激活TRPV1預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化及腦卒中的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)、腦卒中(Stroke)是高血壓的重要并發(fā)癥，它們之間關(guān)系密切，相互影響。根據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2010》顯示，我國(guó)北方高血壓發(fā)病率明顯高于南方，河北高達(dá)41.05%，而進(jìn)食辣椒較多的四川地區(qū)為18.68%。為此，我們猜想膳食辣椒習(xí)慣的差異可能是四川地區(qū)高血壓發(fā)病率低的一個(gè)重要原因，而辣椒中的主要成分辣椒素是瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族1(Transient R

2、eceptor Potentialcation channel subfamily V member1，TRPV1)的高選擇性激動(dòng)劑，提示辣椒素可能通過激活TRPV1具有重要的心血管保護(hù)作用。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化作為冠心病和腦卒中主要病因，主要是由于脂質(zhì)代謝紊亂引起的血管慢性炎癥。典型的病理改變是在血管中形成脂紋、纖維斑塊和粥樣斑塊。隨著年齡的逐漸增長(zhǎng)，脂質(zhì)斑塊會(huì)在人的主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈出現(xiàn)。AS早期，外周血中的單核細(xì)胞粘

3、附到血管內(nèi)皮組織表面，然后遷移穿過內(nèi)皮細(xì)胞層，進(jìn)入血管內(nèi)膜，吞噬大量的脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞。在這個(gè)過程中，單核細(xì)胞的膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)非常重要。研究表明，在人和動(dòng)物中膽固醇的攝取和流出受一系列相關(guān)受體的調(diào)控，包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體1(ATP-binding cassette transporter type1，ABCA1)和過氧化物酶體增生物激活受體δ(Peroxisome proliferator-activated receptorδ，PP

4、ARδ)等，但是它們?cè)趧?dòng)脈粥樣硬化過程中對(duì)單核細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究較少。Ma等研究證實(shí)激活血管平滑肌細(xì)胞中的TRPV1，可以上調(diào)ABCA1的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，同時(shí)下調(diào)LRP1的表達(dá)，減少細(xì)胞對(duì)氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)的攝取，減少平滑肌細(xì)胞的泡沫化，最終減少高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。而作為泡沫細(xì)胞來源的另一來源的單核細(xì)胞，

5、TRPV1是否存在，是否也影響它的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，這方面的研究較少。
　　 腦卒中是一種急性腦血管疾病，它給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。雖然腦卒中的治療取得了巨大的進(jìn)展，但是它的有效預(yù)防措施需要深入研究。與高血壓發(fā)病率一樣，在《我國(guó)人群腦卒中發(fā)病率、死亡率的流行病學(xué)研究》中顯示：膳食辣椒較多的四川地區(qū)年齡標(biāo)化的腦卒中發(fā)病率僅為1.1‰，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于不喜歡進(jìn)食辣椒的北方(河北為5.5‰)。Yang等研究發(fā)現(xiàn)通過激活血管中的T

6、RPV1可以上調(diào)蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)，增加血管內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric-oxidesynthase，eNOS)的表達(dá)，促進(jìn)一氧化氮(nitric oxide，NO)合成和釋放，改善自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously Hypertensive Rats，SHR)腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，最終達(dá)到降壓的目的。我們假設(shè)TRPV1參與了單核細(xì)胞的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)，通過

7、eNOS途徑可以改善SHRsp腦血管的功能，最終預(yù)防人群動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)物腦卒中的發(fā)生。
　　 為了證實(shí)我們的假設(shè)，本研究分二個(gè)部分。第一部分通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription and polymerase chain reaction，RT-PCR)、Western-blot和免疫熒光技術(shù)證實(shí)TRPV1在人的單核細(xì)胞中表達(dá)并具有功能，通過鈣離子的測(cè)定，證實(shí)單核細(xì)胞上的TRPV1具有生理學(xué)功能；通

8、過測(cè)定單核細(xì)胞中3H-膽固醇的放射性，觀察TRPV1對(duì)單核細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；使用Western-blot證實(shí)ABCA1和PPARδ參與了TRPV1介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝；對(duì)喜食辣椒和不喜食辣椒的人群觀察研究，了解他們的一般情況，血糖血脂及血管功能，檢測(cè)單核細(xì)胞的功通，探討是否對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有影響。第二部分證實(shí)TRPV1在鼠的腦血管是否存在，觀察膳食干預(yù)激活TRPV1后小鼠腦動(dòng)脈中的eNOS的蛋白表達(dá)，使用血管環(huán)技術(shù)了解TRPV1對(duì)小鼠腦動(dòng)脈

9、舒張功能的影響；然后我們觀察了辣椒素膳食干預(yù)對(duì)自發(fā)性高血壓自發(fā)性腦卒中大鼠(Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rats，SHRsp)的影響，觀察激活TRPV1是否增加SHRsp腦動(dòng)脈中eNOS蛋白表達(dá)，對(duì)腦動(dòng)脈的舒張反應(yīng)有沒有作用、腦動(dòng)脈的內(nèi)膜一中膜厚度的變化，對(duì)SHRsp腦卒中的發(fā)作是否有影響。
　　 材料與方法：
　　 整個(gè)研究包括離體、在體實(shí)驗(yàn)和人群研究。離體實(shí)驗(yàn)主要觀

10、察人單核白血病細(xì)胞株(human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)和人外周血單核細(xì)胞，證實(shí)細(xì)胞上TRPV1的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣的變化，小鼠和大鼠的腦動(dòng)脈血管反應(yīng)性檢測(cè)。在體實(shí)驗(yàn)主要觀察膳食辣椒素對(duì)SHRsp腦卒中發(fā)作的影響和腦血管中的蛋白表達(dá)。人群研究主要觀察喜食辣椒和不喜食辣椒兩組人群的一般情況、生化指標(biāo)、頸動(dòng)脈形態(tài)及肱動(dòng)脈和下肢動(dòng)脈功能和單核細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的情況及影響機(jī)制。
　　

11、 1.使用RT-PCR、Western-blot、免疫熒光技術(shù)和細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光染料檢測(cè)等技術(shù)，探討TRPV1在人的單核細(xì)胞中的表達(dá)和功能。
　　 2.通過對(duì)單核細(xì)胞中3H-膽固醇放射性的測(cè)定，觀察TRPV1對(duì)單核細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)。
　　 3.使用Western-blot技術(shù)，檢測(cè)TRPV1對(duì)單核細(xì)胞脂代謝調(diào)節(jié)蛋白的影響。
　　 4.使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)人群的血糖、血脂、腎功和CRP，采用多普勒超聲檢測(cè)人群的頸

12、動(dòng)脈形態(tài)和肱動(dòng)脈、下肢動(dòng)脈功能，使用放射性檢測(cè)觀察人群?jiǎn)魏思?xì)胞對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，使用Western-blot技術(shù)檢測(cè)人群?jiǎn)魏思?xì)胞中脂代謝調(diào)節(jié)蛋白的變化，最終比較TRPV1對(duì)人群動(dòng)脈粥樣硬化的影響。
　　 5.使用Western-blot和免疫熒光技術(shù)，證實(shí)TRPV1在腦血管中的表達(dá)和分布。
　　 6.使用Western-blot觀察TRPV1對(duì)腦血管中eNOS表達(dá)的調(diào)控。
　　 7.使用血管張力測(cè)定觀察TRPV

13、1對(duì)小鼠腦動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)的影響，觀察TRPV1對(duì)SHRsp腦動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的影響。
　　 8.使用H.E.染色和尼氏染色，觀察膳食辣椒素激活TRPV1對(duì)SHRsp腦動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)影響，觀察腦出血周圍神經(jīng)細(xì)胞的損傷情況。
　　 9.使用統(tǒng)計(jì)學(xué)上死亡-生存曲線的計(jì)算方法，觀察膳食辣椒素激活TRPV1對(duì)SHRsp腦卒中的發(fā)作是否有預(yù)防作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.

14、TRPV1 mRNA和蛋白在THP-1和人外周血單核細(xì)胞中有表達(dá)。
　　 2.辣椒素刺激THP-1細(xì)胞引起濃度依賴性[Ca2+]i升高，辣椒素的這種作用能被TRPV1阻斷劑辣椒卓平所抑制。
　　 3.辣椒素能減少人單核細(xì)胞株THP-1對(duì)3H-膽固醇的攝取，辣椒素的這種作用能被辣椒卓平所抑制。
　　 4.辣椒素可以增加人單核細(xì)胞株THP-1中ABCA1和PPARδ蛋白的表達(dá)，辣椒卓平可以抑制辣椒素的這種作用。

15、>　　 5.與對(duì)照組相比，喜食辣椒人的外周血單核細(xì)胞對(duì)3H-膽固醇攝取減少，p-PKA、ABCA1和PPARδ蛋白表達(dá)增加，男性的HDL-C增高，頸動(dòng)脈斑塊個(gè)數(shù)減少。
　　 6.大鼠和小鼠的頸動(dòng)脈有TRPV1表達(dá)，且與eNOS共同分布在血管的內(nèi)膜和外膜上。
　　 7.辣椒素呈濃度依賴性的舒張大鼠和小鼠的腦動(dòng)脈，這種作用依賴于內(nèi)皮細(xì)胞，可以被eNOS抑制劑L-NAME所阻斷。
　　 8.膳食辣椒素可以增加小鼠腦動(dòng)

16、脈的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，與辣椒素上調(diào)腦動(dòng)脈eNOS表達(dá)有關(guān)。
　　 9.膳食辣椒素干預(yù)SHRsp可以上調(diào)SHRsp腦動(dòng)脈中的TRPV1和eNOS的表達(dá)，增加腦動(dòng)脈的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。
　　 10.辣椒素激活TRPV1可以減輕SHRsp腦動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜的增厚。
　　 11.辣椒素激活TRPV1可以延緩SHRsp腦卒中的發(fā)作。
　　 結(jié)論：
　　 1、TRPV1在人單核細(xì)胞和鼠的腦動(dòng)脈中均有表達(dá)。T

17、RPV1激動(dòng)劑可呈濃度依賴性的引起THP-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加。膳食辣椒類食品可以上調(diào)人的單核細(xì)胞中TRPV1的表達(dá)；膳食辣椒素可以上調(diào)SHRsp腦動(dòng)脈中TRPV1的表達(dá)。
　　 2、長(zhǎng)期膳食辣椒能激活人單核細(xì)胞上的TRPV1，減少單核細(xì)胞對(duì)3H-膽固醇的攝取，上調(diào)單核細(xì)胞中ABCA1和PPARδ蛋白的表達(dá)，增加男性外周血中的HDL-C水平，減少男性頸動(dòng)脈斑塊個(gè)數(shù)，提示TRPV1參與人動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)。
　　 3、長(zhǎng)