激活TRPV1改善血管功能和預(yù)防高血壓的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：高血壓是臨床常見病和多發(fā)病，其主要并發(fā)癥有中風(fēng)、心肌梗死及腎功能衰竭，嚴(yán)重危害人們的身心健康。原發(fā)性高血壓發(fā)生機(jī)制目前尚不十分清楚，目前認(rèn)為高血壓病的病因為多因素，可分為遺傳因素和環(huán)境因素兩個方面，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。原發(fā)性高血壓發(fā)病率呈上升趨勢，其防治具有重要意義。流行病學(xué)研究表明，多種飲食因素可影響血壓，在過去的十余年中，通過減少鈉鹽的攝入、增加鉀鹽的攝入和增加以蔬菜和水果為基礎(chǔ)的“清淡飲食”的攝入，可有

2、效的降低血壓。紅辣椒的主要成分一辣椒素，常常作為一種食品添加劑，是短暫受體電位通道-香草醛亞型1(TRPV1)的高選擇性激動劑。TRPV1主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)中，激活TRPV1可引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高。研究發(fā)現(xiàn)，急性激活TRPV1可引起血管舒張，血壓一過性下降：也有研究表明，急性激活TRPV1后，血管收縮，血壓升高。而長期激活TRPV1后，對血管和血壓的影響未見報道。我們既往還發(fā)現(xiàn)，辣椒素可激活脂肪細(xì)胞TRPV1導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣增加，減少脂質(zhì)在細(xì)胞

3、內(nèi)的堆積，辣椒素長期干預(yù)可預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。據(jù)報道，TRPV1在血管內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)。我們推測，長期激活TRPV1可能有助于改善血管功能和預(yù)防高血壓。eNOS和PKA是一氧化氮(NO)的合成和釋放的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，都受鈣信號的調(diào)控。因此我們推測，激活TRPV1可能通過細(xì)胞內(nèi)鈣變化上調(diào)上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成和釋放，從而改善血管功能和預(yù)防高血壓。 為了驗證上述假設(shè)，本研究分為三部分進(jìn)行。第一部分通過R

4、T-PCR、蛋白免疫印跡和免疫熒光染色驗證TRPV1在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠及自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腸系膜動脈中表達(dá)和分布情況。第二部分分題一通過應(yīng)用辣椒素急性激活TRPV1后，觀察其對小鼠腸系膜動脈舒張功能的影響。分題二通過長期辣椒素飲食干預(yù)C57/BL6J野生型小鼠和TRPV1基因敲除型小鼠，觀察TRPV1激活后對血壓正常者血管功能和血壓的影響；分題三通過長期辣椒素飲食干預(yù)SHR大鼠，觀察TRPV1激活后對高血壓者的血管功能和血

5、壓的影響。分題四通過長期辣椒素干預(yù)，觀察其對SHR內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的影響。第三部分通過檢測辣椒素刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)變化，明確內(nèi)皮細(xì)胞上的TRPV1通道的功能變化。通過檢測不同干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞及各組動物腸系膜動脈組織NO合成相關(guān)信號蛋白的表達(dá)，檢測辣椒素刺激后血管和內(nèi)皮細(xì)胞NO合成和釋放的變化情況，明確TRPV1激活后對血管功能和血壓作用的機(jī)制。 材料與方法：整個研究由離體實驗和在體實驗兩部分組成。離體

6、實驗以培養(yǎng)的小鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞以及腸系膜動脈為研究對象。在體試驗采用了多種動物模型。首先以C57/BL6J野生型和TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)小鼠及SHR為模型，分為辣椒素組(含辣椒素飼料喂養(yǎng))和對照組(普通飼料喂養(yǎng))。另外還以TRPV1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因(TRPV1-tg)小鼠、TRPV1雜合子小鼠(TRPV1+/-)及其同窩野生型小鼠為動物模型，均以普通飼料喂養(yǎng)。 1.分別用RT-PCR、蛋白免疫印跡檢測TRPV1蛋

7、白和mRNA在血管內(nèi)皮細(xì)胞和腸系膜動脈中的表達(dá)；用免疫熒光染色法觀察TRPV1在血管內(nèi)皮細(xì)胞和腸系膜動脈中的分布。 2.應(yīng)用小血管張力測定技術(shù)檢測辣椒素急性刺激后或長期干預(yù)后小鼠和SHR腸系膜動脈舒縮功能的變化。 3.采用鼠尾測壓方法測定小鼠及SHR鼠尾血壓變化情況；頸動脈插管測定小鼠平均動脈壓及急性靜脈推注乙酰膽堿和硝酸甘油后的血壓變化情況；應(yīng)用無線遙測信號系統(tǒng)檢測辣椒素干預(yù)后大鼠血壓變化情況。 4.比率熒光成

8、像系統(tǒng)檢測辣椒素刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i的變化，觀察TRPV1特異性拮抗劑辣椒卓平或TRPV1基因敲除后對鈣信號變化的影響。 5.蛋白免疫印跡法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞和腸系膜動脈組織NO合成相關(guān)信號蛋白(PKA、phospho-PKA、eNOS、phospho-eNOS)的表達(dá)。 6.熒光顯像技術(shù)檢測辣椒素刺激對內(nèi)皮細(xì)胞NO合成和釋放的影響，及應(yīng)用TRPV1受體拮抗劑、eNOS抑制劑和IPKA抑制劑對內(nèi)皮細(xì)胞NO生成的

9、影響：比率熒光成像系統(tǒng)檢測辣椒素刺激后小鼠腸系膜動脈NO的合成、釋放情況，應(yīng)用TRPV1受體拮抗劑、eNOS抑制劑對腸系膜動脈NO生成的影響及辣椒素刺激后不同基因型小鼠腸系膜動脈NO的生成情況。 結(jié)果： 1.TRPV1在血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠及SHR大鼠腸系膜動脈中均有表達(dá)。 2.急性激活TRPV1后，呈濃度依賴性方式舒張苯腎上腺素預(yù)收縮的小鼠腸系膜動脈，TRPV1基因敲除后、去除內(nèi)皮、應(yīng)用eNOS抑制劑或PKA抑制

10、劑明顯減弱血管的舒張反應(yīng)。長期激活TRPV1后可顯著改善阻力血管-腸系膜動脈的內(nèi)皮依賴性舒張功能，降低小鼠胸主動脈對血管緊張素II誘導(dǎo)的收縮。 3.長期激活TRPV1或TRPV1過表達(dá)后，可增強小鼠對乙酰膽堿誘導(dǎo)的降壓反應(yīng)。長期激活TRPV1后，可降低SHR的血壓。 4.辣椒素呈濃度依賴性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i的升高，TRPV1基因敲除或辣椒卓平預(yù)處理可抑制[Ca2+]i的升高。 5.辣椒素刺激可顯著上調(diào)

11、野生型小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞phospho-PKA和phospho-eNOS蛋白的表達(dá)，PKA抑制劑可降低phospho-eNOS蛋白的表達(dá)；辣椒素刺激對TRPV1-/-小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞phospho-PKA和phospho-eNOS蛋白的表達(dá)無明顯影響。長期激活TRPV1后，野生型小鼠和SHR腸系膜動脈phospho-PKA和phospho-eNOS蛋白的表達(dá)增強，在TRPV1-/-小鼠中變化不明顯。 6.辣椒素刺激可增加血管內(nèi)皮細(xì)

12、胞NO的合成、釋放，應(yīng)用TRPV1受體拮抗劑、eNOS抑制劑和PKA抑制劑可降低內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成。辣椒素呈濃度依賴性方式增加小鼠腸系膜動脈NO的生成，應(yīng)用TRPV1受體拮抗劑、eNOS抑制劑可減弱NO的合成、釋放；辣椒素刺激后，TRPV1 tg小鼠腸系膜動脈NO生成最強，WT次之，TRPV1-/-最弱。 結(jié)論： 1.TRPV1在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠及SHR腸系膜動脈中均有表達(dá)。 2.急性或長期激活TRPV1后