肝臟線粒體載體蛋白HDMCP解偶聯(lián)功能及其與非酒精性脂肪性肝病關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景與目的： 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損因素所致的，以彌漫性肝大泡性脂肪變、伴或不伴炎癥為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝硬化。近年來，不斷有證據(jù)提示線粒體功能失常在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。解偶聯(lián)蛋白(UCPs)屬于線粒體陰離子載體蛋白超家族，定位于線粒體內(nèi)膜并在多種組織中表達。UC

2、Ps通過對氧化磷酸化的解偶聯(lián)(即質(zhì)子滲漏)而對線粒體的功能和機體代謝活動產(chǎn)生影響。肝臟是人體最大的代謝器官而其在生理狀態(tài)下線粒體的質(zhì)子滲漏占其總耗氧量的20-30％，提示可能存在UCPs在其中起作用。然而迄今為止并未有任何一種UCP在正常肝細胞中表達的報道。肝癌中下調(diào)的線粒體載體蛋白(HDMCP)是新近克隆出來并被證明在肝細胞中特異性表達的線粒體載體蛋白，既往研究在細胞株中發(fā)現(xiàn)其具有降低線粒體膜電位的作用，因此其可能就是人們長期尋找的肝

3、臟特異性UCP。本研究的目的首先是在酵母菌表達體系中進一步研究HDMCP的解偶聯(lián)功能；其次研究HDMCP與NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 研究方法： 在C57小鼠肝臟中用Trizol方法提取總mRNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行PCR特異性擴增HDMCPcDNA，后連接至PMDT18載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后送測序。將測序證實無突變的PMDT18—HDMCP質(zhì)粒再PCR擴增并與pYES2載體連接，同樣轉(zhuǎn)化大腸桿菌后

4、質(zhì)粒測序。將測序正確的pYES2-HDMCP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌，經(jīng)過1％的半乳糖誘導(dǎo)表達后，提取線粒體并立即在30℃下進行呼吸功能測定，主要指標(biāo)包括解偶聯(lián)率、線粒體呼吸控制及GDP抑制率。隨后，本課題通過高脂飲食和油酸、棕櫚酸混合物培養(yǎng)成功構(gòu)建NAFLD大鼠及脂質(zhì)沉積細胞模型，并使用westernblot、RNA干擾等方法研究HDMC在脂質(zhì)沉積中的作用。最后，本課題還采用分光光度法和螢火蟲熒光素酶法分別測定細胞模型中過氧化氫和ATP含量，以

5、研究HDMCP調(diào)控脂質(zhì)水平的下游通路。 本課題比較多地采用生物信息學(xué)的方法，如對HDMCP與UCP1-5的序列比對采用clustalW程序，進化分析主要采用Mega4軟件包中的鄰近法進行構(gòu)樹。在統(tǒng)計學(xué)上，每項實驗至少進行三次，計量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。非配對的兩組間比較采用student'st檢驗(對于非正態(tài)分布的兩組間數(shù)據(jù)比較采用Mann—Whitney法)，兩變量間相互關(guān)系的分析采用直線相關(guān)分析進行。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均由

6、專人錄入并在SPSS11.0中進行分析，p＜0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 通過序列比對發(fā)現(xiàn)HDMCP與UCP1-5有約40％的序列相似度，且表現(xiàn)出線粒體載體蛋白的基本特征。進一步通過進化分析，發(fā)現(xiàn)HDMCPs顯著的與UCP4，UCP5以及無脊椎動物中的UCPs序列更相近，提示進化上其可能更加原始。Westenblot顯示HDMCP在分離的酵母線粒體中表達。由于缺乏OXO和UCP1的特異性抗體，本課題采用實時定量RF—

7、PCR證實了二者mRNA在各自轉(zhuǎn)染的酵母線粒體上的表達(OXO：0.73±0.07；UCP10.81±0.12)。在提取線粒體并測定解偶聯(lián)率時，本課題發(fā)現(xiàn)HDMCP具有一定GDP非敏感性的解偶聯(lián)功能，與OXO和pyes2陰性對照及UCP1陽性對照相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。 與對照相比，肝指數(shù)、血清膽固醇與甘油三酯、肝臟甘油三酯含量以及HOMA—IR指數(shù)在NAFLD均有顯著性增高。此外，westernblot顯示H

8、DMCP在NAFLD模型組中顯著增高。而細胞脂質(zhì)含量及甘油三酯水平在模型組也比對照組有2-7倍的增高。隨著高脂培養(yǎng)時間的延長，HDMCP水平逐漸上升。通過RNA干擾，L02與HepG2細胞中HDMCP的表達分別下調(diào)了60％與62％，伴細胞脂質(zhì)含量及甘油三酯的顯著增高，而control—shRNA則無顯著作用。此外，NAFLD動物與細胞模型中的ATP含量以及細胞模型中的H2O2(ROS的代表物)水平比對照均呈顯著下降，然而這種作用部分被H

9、DMCP—shRNA通過下調(diào)HDMCP水平所抑制。同時ATP水平與其相應(yīng)的HDMCP水平呈負相關(guān)(r=-0.93，L02細胞，p＜0.05；r=-0.91HepG2細胞，p＜0.05)。 結(jié)論： 1)通過在酵母表達系統(tǒng)中表達HDMCP，本課題驗證了其具有GDP非敏感性的解偶聯(lián)功能，支持“HDMCP可能就是研究人員長期尋找的肝臟特異性的解偶聯(lián)蛋白”這一假說，為全面理解生理狀態(tài)下肝臟線粒體能量代謝提供理論支持。 2)

10、本課題首次發(fā)現(xiàn)并闡明HDMCP在NAFLD大鼠模型及單純脂變模型中表達上升，通過進一步研究發(fā)現(xiàn)HDMCP具有部分調(diào)節(jié)NAFLD細胞模型中脂質(zhì)沉積的作用，而且該調(diào)控可能通過降低ATP與H2O2的產(chǎn)生起作用，可能是機體面對脂肪過剩情況下的適應(yīng)性反應(yīng)。因此，HDMCP可能成為今后NAFLD治療干預(yù)的新靶點。 3)由于H2O2是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，因此，本課題的研究也提示HDMCP可能在NAFLD從單純性脂變向NASH的進展中起到重要