更年期綜合征及貫葉連翹治療機制的代謝組學(xué)研究.pdf

1、[目的和意義]
　　更年期綜合征是干擾中老年婦女生活質(zhì)量的重要影響因素。雖然現(xiàn)代分子學(xué)已發(fā)現(xiàn)更年期綜合征可能與內(nèi)分泌、免疫、自由基及細胞凋亡有關(guān)，但這些獨立的機制與病理表征之間的聯(lián)系仍不明確。
　　貫葉連翹被認為是治療更年期綜合征長效、安全的中草藥之一，臨床用于替代雌激素療法，以降低因長期服用雌激素而罹患乳腺癌、冠心病、中風(fēng)和血栓的風(fēng)險。在治療更年期抑郁、潮熱、肥胖、記憶衰退、風(fēng)濕類風(fēng)濕等疾病方面療效尤其顯著。然而貫葉連翹活

2、性成分十分復(fù)雜，且給藥劑量多樣，使其臨床治療有效性受到質(zhì)疑。目前大部分的臨床研究主要集中在貫葉連翹的抗抑郁作用上，但這些研究成果并不適于對更年期綜合征治療機制的解釋，說明貫葉連翹的治療策略及對更年期綜合征的干預(yù)機制還有待于進一步發(fā)掘。
　　為了了解更年期綜合征的代謝特征，探索貫葉連翹在治療過程中對已知或未知生物通路的作用。本研究利用一維核磁共振(1H-NMR)靶向代謝組學(xué)及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)的發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)研究方法

3、，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，尋找濃度或豐度改變顯著的模型差異表達代謝物，通過鑒定代謝物結(jié)構(gòu)，構(gòu)建更年期綜合征體內(nèi)代謝輪廓與疾病代謝表型關(guān)系的代謝網(wǎng)絡(luò)，從生化、病理和代謝三個水平深入研究貫葉連翹對更年期綜合征的代謝調(diào)控，期望從代謝物水平上揭示貫葉連翹對更年期綜合征的調(diào)控機制。
　　[研究方法]
　　1.以大鼠去卵巢模型模擬更年期婦女卵巢激素缺乏導(dǎo)致更年期綜合征的病理狀態(tài)。采用1H-NMR及HPLC-MS/MS技術(shù)，對OVX及正常樣本

4、進行快速代謝物差異分析，靶向測定差異表達的代謝物，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，選定疾病診斷生物標(biāo)記物。
　　2.利用ChenomxNMR定量分析軟件對生物樣本中的小分子代謝物進行定量，建立1H-NMR靶向代謝組學(xué)研究方法。
　　3.，采用HPLC-MS/MS技術(shù)，以多個pH值液液萃取系統(tǒng)提取尿樣代謝物，建立了非靶向的、基于質(zhì)譜的發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)研究方法，以增加1H-NMR測定結(jié)果的可靠性。
　　4.對不同劑量貫葉連翹給予OVX大

5、鼠后的代謝特征進行分類比較，鑒定并定量分析貫葉連翹對更年期綜合征干預(yù)的差異表達代謝物。尋找給藥靶器官，構(gòu)建貫葉連翹治療機制的代謝網(wǎng)絡(luò)，選定治療生物標(biāo)記物，建立代謝組學(xué)藥物治療療效評價模型。
　　[結(jié)果與討論]
　　1.以偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和方差分析方法對1H-NMR和HPLC-MS/MS分別得到的代謝物進行篩選，結(jié)果得到53個與更年期綜合征診斷相關(guān)的差異表達代謝物。將代謝物進行代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后發(fā)現(xiàn)，有6條代謝通

6、路與更年期綜合征顯著相關(guān)，包括糖酵解和糖異生、三羧酸循環(huán)、脂肪酸生物合成與氧化代謝、蛋氨酸循環(huán)、一碳單位途徑和尿素循環(huán)（精氨酸及脯氨酸代謝）途徑。
　　其中，檸檬酸、3-羥基丁酸和丙酮酸水平下降，棕櫚酸、肉毒堿和乙酰基肉毒堿水平上升可作為更年期體重異常的診斷標(biāo)記物;膽堿、甜菜堿和蛋氨酸水平上升，?；撬岷蚇，N-二甲基甘氨酸(DMG)水平下降可作為更年期抑郁癥的診斷標(biāo)記物;γ-氨基丁酸水平下降，谷氨酸、組氨酸、甲基組氨酸和精氨酸水平

7、上升可作為更年期記憶衰退的診斷標(biāo)記物;鳥氨酸、胞嘧啶、β-丙氨酸和精胺水平上升可作為更年期乳腺癌的診斷標(biāo)記物;血清尿囊素、谷氨酸水平上升，谷氨酰胺水平下降可作為更年期痛風(fēng)的診斷標(biāo)記物;5-羥色胺(5-HT)、色氨酸和甲酸水平下降，3-吲哚磺酸水平上升可作為更年期潮熱及慢性腎病的診斷標(biāo)記物。
　　2.對不同月齡大鼠尿樣代謝物水平比較結(jié)果顯示，有29個差異表達的代謝物與年齡增長有關(guān)，與對照組相比大部分代謝物呈現(xiàn)下降趨勢。其中煙酰胺、N

8、-甲基煙酰胺、胍基丁胺、亞精胺和精胺被選定為指示自然更年期疾病的生物標(biāo)記物。這些代謝物水平的降低，可以用于預(yù)測肝臟線粒體功能隨著機體衰老而逐漸減少，NAD+呼吸鏈反應(yīng)效能降低，機體氧化應(yīng)激反應(yīng)加速產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)增多，最終導(dǎo)致心血管疾病、糖尿病和認知性疾病等慢性疾病的產(chǎn)生。
　　3.通過比較不同劑量貫葉連翹給藥前后OVX大鼠的代謝物水平結(jié)果顯示，貫葉連翹能夠逆轉(zhuǎn)多個更年期綜合征生物標(biāo)記物的紊亂變化，并呈現(xiàn)出與相關(guān)酶活性及受體飽和度的

9、相關(guān)的治療作用。經(jīng)篩查、鑒定和定量給藥前后血清和尿樣中的差異調(diào)節(jié)代謝物，有23個代謝物在解釋貫葉連翹治療機制方面具有重要意義。代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果顯示，與貫葉連翹治療機制相關(guān)的代謝物和中間體生化途徑涉及4條主要代謝通路，包括精氨酸和脯氨酸代謝途徑、丙酮酸代謝途徑、組氨酸代謝途徑和脂肪酸合成途徑。
　　結(jié)合代謝物水平變化與代謝通路分析顯示，貫葉連翹作用的主要靶器官是肝臟，其治療作用是從調(diào)節(jié)肝臟代謝中精氨酸、鳥氨酸、蛋氨酸、?；撬?、肉毒堿

10、和三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物的水平恢復(fù)開始的。其次使膽堿、甜菜堿生成正常，改善了脾臟的退行性變化，增強了脾臟的抗炎作用，進一步抑制了與炎癥效應(yīng)相關(guān)的更年期阿爾茨海默病、糖尿病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的產(chǎn)生。另外，貫葉連翹還能通過顯著降低3-吲哚磺酸在腎臟的蓄積，降低腎小管上皮細胞中的NF-kappaB表達，產(chǎn)生解毒效應(yīng)，使慢性腎臟疾病癥狀得到緩解。3-吲哚磺酸水平下降使得色氨酸水平恢復(fù)正常，促進色氨酸代謝生成5-HT，恢復(fù)5-HT對體溫中樞的調(diào)

11、節(jié)能力，產(chǎn)生緩解潮熱癥狀的作用。
　　[結(jié)論]
　　1.本研究運用1H-NMR和HPLC-MS/MS技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計方法，對更年期雌激素衰亡誘發(fā)代謝紊亂的分子機制進行表征，構(gòu)建了代謝物水平與疾病產(chǎn)生的代謝網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有53個代謝物的差異表達與更年期綜合征代謝紊亂相關(guān)，這些代謝物的水平變化可以作為更年期綜合征不同癥型的診斷標(biāo)記物。其中，3-吲哚磺酸是首次在更年期綜合征動物模型發(fā)現(xiàn)的與更年期慢性腎病相關(guān)的重要生物標(biāo)記物。同時

12、，3-吲哚磺酸水平異常還和更年期潮熱癥狀有很大關(guān)系。
　　2.本階段研究首次將煙酰胺、N-甲基煙酰胺、胍基丁胺、亞精胺、精胺選定為指示細胞生長速率下降導(dǎo)致機體衰老的潛在生物標(biāo)記物，并有待于HPLC-MS/MS靶向代謝組學(xué)的進一步驗證。
　　3.在貫葉連翹治療機制研究中，找到與治療相關(guān)的差異表達代謝物共29個。研究揭示了貫葉連翹對更年期綜合征治療作用的主要靶器官為肝臟和脾臟，其次為腎臟。其中，本研究首次發(fā)現(xiàn)貫葉連翹對GABA、

13、多巴胺和5-HT受體的調(diào)控作用與其對精氨酸、丙酮酸和色氨酸代謝途徑的調(diào)節(jié)有密切關(guān)系。尤其是給藥后尿樣中乙酸水平顯著升高，顯示出貫葉連翹對丙酮酸代謝途徑中乙酸→乙醛酸通路的干預(yù)結(jié)果。揭示了貫葉連翹一個重要治療機制是對丙酮酸代謝途徑中乙醛脫氫酶2(ALDH2)的調(diào)節(jié)作用。使ALDH2不僅通過降低氧化應(yīng)激減少機體炎癥和細胞凋亡的發(fā)生來降低更年期糖尿病、帕金森病的產(chǎn)生，還能抑制多巴胺降解生成神經(jīng)毒性化合物3，4-dihydroxyphenyla