鹿茸發(fā)育相關(guān)基因篩選和生物信息學(xué)分析.pdf

1、鹿茸是一種骨質(zhì)性器官，每年都能脫落后再生，是哺乳動物中唯一能完全再生的器官，其他的哺乳動物無法再生出失去的器官。因此，鹿茸就提供了一個絕無僅有的模型來研究哺乳動物內(nèi)在的再生機(jī)制。然而，鹿茸再生的分子機(jī)制至今沒有弄清楚。鹿茸發(fā)育是一個非常獨(dú)特的復(fù)雜的過程，涉及到軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨等骨生長方式。許多研究表明鹿茸再生是基于干細(xì)胞(骨膜細(xì)胞)，不涉及到細(xì)胞的去分化，不同于蠑螈肢體再生過程。鹿茸再生首先形成胚芽或茸芽狀的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，在這個微環(huán)境中

2、，存在細(xì)胞分裂、分化，鹿茸發(fā)育的干細(xì)胞，多能祖細(xì)胞受到復(fù)雜的信號調(diào)控。在梅花鹿的鹿茸發(fā)育中，細(xì)胞分化、增殖和凋亡都是受特定基因表達(dá)調(diào)控。鹿茸頂端的間充質(zhì)組織在鹿茸頂端的形態(tài)發(fā)生，乃至整個鹿茸的發(fā)育過程中起著重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用cDNA-AFLP技術(shù)篩選梅花鹿鹿茸發(fā)育過程中兩個重要時期的間充質(zhì)組織的差異表達(dá)基因片段，獲得鹿茸發(fā)育相關(guān)的基因。這種技術(shù)是用兩種限制性內(nèi)切酶酶切，在嚴(yán)格的條件下，64對引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚

3、丙烯酰胺凝膠電泳，再進(jìn)行銀染，篩選出鹿茸發(fā)育過程中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，然后用RT-PCR進(jìn)行鑒定，該實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性強(qiáng)。得到許多兩個發(fā)育時期的鹿茸差異表達(dá)基因，選取9個差異表達(dá)基因進(jìn)行克隆測序，然后進(jìn)行EST生物信息學(xué)分析。首先對EST序列進(jìn)行預(yù)處理、聚類和拼接，把來源于同源于同一基因EST拼接成contig，其次利用nr數(shù)據(jù)庫，EST數(shù)據(jù)庫和GO數(shù)據(jù)庫，獲得更多的信息，并對EST進(jìn)行功能注釋。 結(jié)果表明：有兩個片段來源于同一個基因，

4、利用生物軟件拼接成contig，即AF78，把未能拼接ESTs和此contig(AF78)進(jìn)行比對分析和功能注釋，獲得相關(guān)基因信息。上調(diào)基因有2個，即AF1和AF2。AF1功能未知，AF2的同源序列是人的TRPV4，TRPV4通道是瞬時感受器電位離子通道家族香草素受體亞家族成員，屬非選擇性陽離子通道，對鈣離子具有適中通透性，在軟骨的形成中起著重要的作用。下調(diào)基因有6個，即AF3-AF6，AF78(contig)和AF9。其中AF6基因功

5、能未知，AF3的同源序列是人的FAS，該基因是促凋亡基因，屬于腫瘤壞死因子受體家族成員之一，與哺乳類動物細(xì)胞凋亡密切相關(guān)；AF4的同源序列是人的WNT3，是Wnt基因家族成員，在細(xì)胞增殖、分化過程中起著重要的作用，Wnt信號通路在發(fā)育過程中具有重要的作用；AF5的同源序列是人的TGFβ1，是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員，該基因編碼的是一種分泌性蛋白，扮演著許多細(xì)胞功能，如對細(xì)胞生長，細(xì)胞增殖和分化，還有凋亡的調(diào)控；AF78的同源序列是獼猴

6、的CDK2，周期依賴性激酶2，該基因編碼的是蛋白激酶家族的一員，啟動真核細(xì)胞周期的關(guān)鍵時期；AF9的同源序列是人的APAF1，該基因稱為凋亡酶激活因子-1，在凋亡途徑中具有重要作用。這些功能己知的基因都與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如Wnt/β-action，TGF/TGFR等信號通路：細(xì)胞分裂、增殖、分化和凋亡有關(guān)，在鹿茸的發(fā)育過程中起著重要的作用，有些基因是鹿茸研究中首次提到的，有些是新基因，都通過RT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)為鹿茸再生和器官再生的