幽門螺桿菌臨床菌株主要蛋白抗原表達及其誘導宿主抗體水平差異性的研究.pdf

1、幽門螺桿菌感染與人慢性胃炎、消化道潰瘍和胃腺癌的發(fā)病密切相關。一些抗生素可有效殺滅感染的幽門螺桿菌，但存在再次感染和誘導細菌產生耐藥性等問題。接種疫苗是預防傳染病最為經濟和有效的方法，但至今尚無幽門螺桿菌疫苗產品。幽門螺桿菌培養(yǎng)條件苛刻、生長緩慢、產量極低，故基因工程疫苗可能是研發(fā)該菌疫苗唯一可行的途徑。目前最為肯定的幽門螺桿菌蛋白抗原是尿素酶B亞單位(UreB)和幽門螺桿菌黏附素(HpaA)，其次是空泡毒素(VacA)、細胞毒性相關蛋

2、白(CagA)、中性粒細胞激活蛋白(NapA)、鞭毛蛋白A亞單位(FlaA)和B亞單位(FlaB)等。然而，不同國家和地區(qū)同種細菌的優(yōu)勢基因型和抗原表型可有較大差別。
　　 本研究建立了基于幽門螺桿菌重組蛋白抗原rUreB、rHpaA、rVacA、rCagAl、rNapA、rFlaA和rFlaB及其抗體的ELISAs，檢測了分離自胃炎或消化道潰瘍病人胃黏膜145株幽門螺桿菌臨床菌株上述抗原的表達情況，以及145例病人血清中上述抗

3、原的IgG抗體；另采用PCR檢測了上述幽門螺桿菌臨床菌株中各抗原編碼基因攜帶情況，以期為研制我國幽門螺桿菌基因工程疫苗的抗原選擇提供較為充分的依據。實驗采用了332例胃炎、消化道潰瘍病人胃黏膜活檢標本和血清標本，以及35例健康體檢兒童的血清標本。采用選擇性哥倫比亞血瓊脂為分離培養(yǎng)基，通過革蘭染色鏡檢、尿素酶試驗和氧化酶試驗對分離的幽門螺桿菌進行鑒定。用IPTG誘導rUreB、rHpaA、rVacA、rCagAl、rNapA、rFlaA和

4、rFlaB表達，Ni-NTA親和層析柱和Westem Bolt分別提純和鑒定目的表達產物。制備上述7種重組表達蛋白抗原的兔抗血清，免疫雙擴散法檢測其效價。用7種重組蛋白為包被抗原，濃度均為2μg/每孔，以病人血清為一抗、HRP標記羊抗人IgG為二抗，建立檢測血清標本中上述抗原IgG抗體的ELISAs。用幽門螺桿菌NCTC11637株及臨床分離菌株、10株大腸桿菌和10株金黃色葡萄球菌(陰性對照)的超聲波破碎物上清為包被抗原，濃度均為5μ

5、g蛋白/每孔，上述7種幽門螺桿菌重組蛋白抗原兔抗血清為一抗、HRP標記羊抗兔IgG為二抗，建立檢測幽門螺桿菌臨床菌株中上述7種抗原的ELISAs。采用PCR檢測幽門螺桿菌臨床菌株ureB、hpaA、vacA、cagA、napA、flaA和flaB基因，采用瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。
　　 實驗結果顯示，332例慢性胃炎或消化性潰瘍病人胃黏膜活檢標本中，幽門螺桿菌分離陽性率為43.8％(145/332)。7種重組蛋白抗原表達

6、量分別約為細菌總蛋白的15％～56％，提純后經SDS-PAGE后均顯示為單一條帶并可與幽門螺桿菌全菌抗體形成陽性雜交結果。7種重組蛋白抗原兔抗血清的免疫雙擴散效價1:4～1:80100％(145/145)、86.9％(126/145)、42.8％(62/145)、70.3％(102/145)、89.7％(130/145)、84.8％(123/145)和79.3％(115/145)幽門螺桿菌感染病人血清標本中分別為UreB、HpaA、Va

7、cA、CagA、NapA、FlaA和FlaB抗體檢測結果陽性。所有幽門螺桿菌臨床菌株(100％，145/145)均表達UreB、HpaA、FlaA和FlaB，52.4％(76/145)、91.7％(133/145)和93.1％(135/145)幽門螺桿菌臨床菌株表達VacA、CagA和NapA。所有幽門螺桿菌臨床菌株(100％，145/145)areB、hpaA、vacA、flaA和flaB基因PCR結果陽性，96.6％(140/145

8、)和97.9％(142/145)幽門螺桿菌臨床菌株cagA和napA基因PCR結果陽性。
　　 研究表明：⑴幽門螺桿菌臨床菌株7種蛋白抗原基因攜帶率和表達率有明顯差異，ureB、hpaA、flaA、flaB、cagA和napA基因均顯示為高攜帶和高表達狀況，vacA基因攜帶率為100％但表達率僅為52.4％。⑵幽門螺桿菌感染的胃炎、消化道潰瘍病人血清中UreB抗體陽性率為100％，與幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因攜帶率和表達率相符

9、；NapA、HpaA和FlaA抗體陽性率較高(84.8％～89.7％)，但低于幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因攜帶率和表達率；VacA和CagA抗體陽性率較低(42.8％，70.3％)，與幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因高攜帶率或高表達率之間的差距很大。⑶綜合上述7種幽門螺桿菌蛋白抗原基因攜帶、表達及病人血清抗體陽性率檢測結果，同時考慮各重組蛋白抗原表達產量差異，我們認為首先是rUreB、其次是rNapA和rHpaA較為適用于幽門螺桿菌基因重組