增加β-,1-和β-,2--AR的表達(dá)對異丙腎上腺素?fù)p傷的大鼠心肌細(xì)胞收縮功能和存活的影響及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、心肌細(xì)胞上存在著β<,1>和β<,2>一腎上腺素受體(β<,1>、β<,2>-AR)，在正常心臟中，由兒茶酚氨引起的收縮反應(yīng)，主要是通過β<,1>-AR介導(dǎo)的，β<,2>-AR信號系統(tǒng)的反應(yīng)較弱。心衰時，循環(huán)中兒茶酚氨水平升高，心臟對交感刺激的敏感性降低，β<,1>腎上腺素受體(β<,1>-AR)密度下調(diào)，因而，心肌的收縮能力相對減弱，出現(xiàn)代償性心率加快，心肌耗氧增加，心排血量降低，導(dǎo)致左室舒張末壓升高，心功能惡化。針對這一系列病理變化

2、，以往應(yīng)用β腎上腺素受體(β-AR)阻滯劑，通過減慢心率，降低血壓，減輕后負(fù)荷，降低心肌耗氧量等，從而改善心功能。但是應(yīng)用β-AR阻滯劑并沒有從根本上增加心肌的收縮能力。另外，在心力衰竭和老化的心臟中由于β<,1>-AR的選擇性下調(diào)，β<,2>-AR的生理作用可能顯著提高，心力衰竭時β<,2>-AR在交感神經(jīng)沖動和外源性交感激動劑產(chǎn)生的正性肌力作用和正性變時作用中占重要的地位。 因衰竭心肌細(xì)胞中β<,1>-AR密度下調(diào)，β<,2

3、>-AR的作用相對增加，所以人們試圖通過某些途徑增加受體的密度來增加心肌收縮力。在基因敲除的動物身上過表達(dá)β<,1>或β<,2>-AR可使心肌收縮功能和舒張功能顯著增強(qiáng)，但在心衰的大鼠心肌細(xì)胞上和兒茶酚氨損傷的心肌細(xì)胞上過表達(dá)β<,1>和β<,2>-AR是否能改善心肌細(xì)胞的收縮功能，對心肌細(xì)胞是否有保護(hù)作用，國內(nèi)外報道較少。目前對兒茶酚氨導(dǎo)致的心肌損傷過程中，β-AR是如何變化以及起著什么樣的作用也還處于不斷深入的研究中。從細(xì)胞水平上探

4、討β<,1>、β<,2>-AR表達(dá)增加對受損心肌細(xì)胞的收縮功能的影響，有助于深入認(rèn)識β-AR在心血管疾病中的作用。本實驗首先用異丙腎上腺素在細(xì)胞水平上損傷心肌細(xì)胞，觀察增加β<,1>、β<,2>-AR表達(dá)對心肌細(xì)胞收縮功能和死亡的影響，并對作用機(jī)制進(jìn)行初步探討；然后我們制作大鼠心衰模型，在心衰的心肌細(xì)胞上分別增加β<,1>、β<,2>-AR表達(dá)，觀察對其收縮功能的影響。主要內(nèi)容概括如下： 一．增加β<,1>和β<,2>腎上腺素受

5、體表達(dá)對培養(yǎng)的異丙腎上腺素?fù)p傷的大鼠心肌細(xì)胞收縮功能的影響 目的：探討增加β<,1>、β<,2>-AR表達(dá)對異丙腎上腺素?fù)p傷培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞收縮功能的影響。 方法：在分離、培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上分別轉(zhuǎn)入β<,1>和β<,2>-AR，然后在培養(yǎng)液中加入5μM的異丙腎上腺素慢性刺激心肌細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，觀察比較不同組別的單個心肌細(xì)胞的收縮幅度的變化。 結(jié)果：β<,1>-AR表達(dá)增加提高了培養(yǎng)的正常大鼠心肌細(xì)胞對異

6、丙腎上腺素引起的收縮的幅度(P<0.01，vs control)，這一效應(yīng)可被選擇性β<,2>-AR拮吉抗劑 ICI118，551阻斷(P<0.05，Adv．β<,1>+ICI vs Adv．β<,1>)。β<,1>-AR表達(dá)增加可使異丙腎上腺素?fù)p傷的心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)收縮和異丙腎上腺素刺激的收縮的幅度均降低(P<0.01 and P<0.05， respectively)。β<,2>-AR表達(dá)增加提高了正常培養(yǎng)24小時的大鼠心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)

7、收縮(P<0.01，vs control)。它還提高了異丙腎上腺素?fù)p傷的心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)收縮和異丙腎上腺素刺激的收縮的幅度(P<0.01，Adv．β<,2>+IS0 vs IS0)。選擇性β<,1>-AR 拮抗劑 CGP20712A下調(diào)了β<,2>-AR表達(dá)增加的正常心肌細(xì)胞和異丙腎上腺素?fù)p傷的心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)收縮和異丙腎上腺素刺激的收縮的幅度。 結(jié)論：在慢性異丙腎上腺素刺激而損傷的大鼠心肌細(xì)胞上，增加β<,1>-AR的表達(dá)進(jìn)一步加

8、劇了因細(xì)胞損傷而引起的收縮幅度的減弱；增加β<,2>-AR的表達(dá)改善了損傷細(xì)胞的基礎(chǔ)收縮和對異丙腎上腺素刺激的反應(yīng)，這一作用與β<,1>-AR有關(guān)。 二．β<,1>和β<,2>-腎上腺素受體表達(dá)增加對培養(yǎng)的異丙腎上腺素?fù)p傷的大鼠心肌細(xì)胞的存活的影響與Bax/Bcl-2及Gi通路有關(guān) 目的：觀察增加β<,1>-AR和β<,2>-AR的表達(dá)對培養(yǎng)的異丙腎上腺素?fù)p傷的大鼠心肌細(xì)胞的存活的影響并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方

9、法：用腺病毒作載體，在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上增加β<,1>或β<,2>-AR或Gi基因的表達(dá)；然后在培養(yǎng)基中加入5μM的異丙腎上腺素以損傷心肌細(xì)胞，24小時后記數(shù)各組細(xì)胞的存活率，并檢測Bax和Bcl-2的含量。 結(jié)果：轉(zhuǎn)入β<,1>和β<,2>-AR基因后，心肌細(xì)胞上β<,1>和β<,2>-AR的含量分別為正常對照組的2.98倍和2.87倍。增加β<,1>-AR的表達(dá)，加劇了異丙腎上腺素引起的細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活率降低。如果用選擇性β

10、<,2>-AR拮抗劑ICl118，551阻斷β<,2>-AR的功能，可使存活率進(jìn)一步下降。增加β<,2>-AR的表達(dá)，部分反轉(zhuǎn)了異丙腎上腺素慢性刺激的毒性效應(yīng)。用選擇性β<,1>-AR拮抗劑CGP20712A阻斷β<,1>-AR的功能，可進(jìn)一步減弱因增加β<,2>-AR的表達(dá)而減弱的異丙腎上腺素的毒性效應(yīng)，細(xì)胞的存活率提高。Western blot分析表明，和異丙腎上腺素?fù)p傷組相比，增加β<,1>-AR和抑制β<,2>-AR增加了Bax

11、/Bcl-2的比率，而增加β<,2>-AR和抑制β<,1>-AR降低了Bax/Bcl-2的比率。Gi表達(dá)增加，對正常培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞的死亡率沒有影響，但能夠減少異丙腎上腺素?fù)p傷引起的細(xì)胞死亡。這種作用可被Gi阻斷劑百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)所阻斷。 結(jié)論：增加β<,2>-AR的表達(dá)和/或抑制β<,1>-AR對培養(yǎng)的異丙腎上腺素?fù)p傷的大鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，增加其存活率。在同樣條件下，增加β<,1>-

12、AR的表達(dá)和/或抑制β<,2>-AR則有損害作用。這種β-ARs對細(xì)胞存活的效應(yīng)與Bax/Bcl-2及Gi信號通路有關(guān)。 三．增加β<,1>-腎上腺素受體表達(dá)對心衰大鼠心肌細(xì)胞收縮功能的影響 目的：心衰時，β-腎上腺素受體反應(yīng)性降低并伴有β<,1>腎上腺素受體密度下調(diào)，心肌收縮力減弱。本試驗觀察在心衰的心肌細(xì)胞上增加β<,1>-AR表達(dá)對收縮功能的影響。 方法：首先用異丙腎上腺素制作大鼠心衰模型，然后分離、培養(yǎng)心

13、肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含人β<,1>-AR基因的腺病毒，24小時后western blot檢測細(xì)胞中β<,1>-AR的含量，并進(jìn)行單個心肌細(xì)胞收縮功能的分析。 結(jié)果：心衰細(xì)胞上β<,1>-AR含量為正常對照組的0.56±0.19倍(P<0.01)，心衰+轉(zhuǎn)基因組β<,1>-AR的含量為正常對照組的5.68±0.36倍(P<0.01)；心衰組心肌細(xì)胞對異丙腎上腺素刺激引起的收縮幅度較正常對照組明顯降低(P<0.01)，轉(zhuǎn)入β<,1>-AR基

14、因后，可明顯改善心衰大鼠心肌細(xì)胞的收縮功能，選擇性β<,1>-AR拮抗劑CGP20712A可以完全阻斷轉(zhuǎn)入β<,1>-AR后的效應(yīng)，選擇性β<,2>-AR拮抗劑ICl118，551可以部分降低心衰大鼠和β<,1>-AR表達(dá)增加的心衰大鼠的心肌細(xì)胞的收縮幅度。 結(jié)論：增加β<,1>-AR的表達(dá)，可改善心衰大鼠心肌細(xì)胞的收縮功能，這種作用可能是直接通過β<,1>-AR實現(xiàn)的。β<,2>-AR也參與了心衰大鼠和β<,1>-AR表達(dá)增加的

15、心衰大鼠心肌細(xì)胞的收縮功能。 四．β<,2>腎上腺素受體表達(dá)增加對心衰大鼠心肌細(xì)胞收縮功能的影響 目的：觀察增加β<,2>-腎上腺素受體的表達(dá)對心衰大鼠心肌細(xì)胞收縮功能的影響并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法：分離培養(yǎng)心衰大鼠心肌細(xì)胞，在其上增加β<,2>-AR的表達(dá)，測定異丙腎上腺素刺激引起的細(xì)胞收縮幅度的改變。 結(jié)果：心衰組心肌細(xì)胞收縮幅度較正常對照組降低(P<0.01)，增加β<,2>-AR表達(dá)可增加心

16、衰組心肌細(xì)胞的收縮幅度(P<0.01，心衰+Adv．β<,2>組vs心衰組)；選擇性β<,2>-AR拮抗劑ICl118，551可部分反轉(zhuǎn)這種效應(yīng)(p<0.05，心衰+Adv．β<,2>+ICI組Vs心衰+AdV．β<,2>組)，但不能使收縮幅度降到心衰組水平(p<0.05，心衰+Adv．β<,2>+ICI組vs心衰組)。選擇性β<,1>-AR拮抗劑CGP20712A可完全阻斷β<,2>-AR表達(dá)增加的效應(yīng)。 結(jié)論：增加β<,2>