β-,2-腎上腺素受體激動(dòng)劑克侖特羅對新生大鼠心肌細(xì)胞的作用研究.pdf

1、β2腎上腺素受體激動(dòng)劑克侖特羅對新生大鼠心肌細(xì)胞的作用研究 β腎上腺素受體(β-adrenergicreceptorβ-AR)，是典型的G蛋白偶聯(lián)受體，至少有3種亞型：β1-、β2-、β3-AR。腎上腺素受體介導(dǎo)的兒茶酚胺效應(yīng)，在心血管功能調(diào)節(jié)中起著重要的作用。傳統(tǒng)認(rèn)為，只有β1-AR才調(diào)節(jié)心臟功能。β1-AR與興奮型Gs蛋白偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)蓄積，從而引起正性變力效應(yīng)，正性變時(shí)效應(yīng)和正性變性

2、效應(yīng)。近來發(fā)現(xiàn)，β1-和β2-AR共同調(diào)節(jié)心臟的功能。但近十年的研究表明，β1-AR僅與Gs偶聯(lián)，而β2-AR同時(shí)與Gs和Gi蛋白雙偶聯(lián)。無論生理還是病理狀況下，β2-AR/Gi偶聯(lián)都抑制了由β2-AR/Gs介導(dǎo)的正性肌力作用和正性舒張作用。因此，β1-和β2-AR在介導(dǎo)心臟功能方面存在差異。研究還發(fā)現(xiàn)，由于新生大鼠心肌細(xì)胞缺乏或很少有β2-AR/Gi偶聯(lián)，β2-AR介導(dǎo)的新生大鼠心臟的生物效應(yīng)與成年大鼠也有所不同。由于種屬、細(xì)胞、以及

3、動(dòng)物年齡等的差異，目前關(guān)于β2-AR對心肌細(xì)胞作用的報(bào)道也結(jié)論不一。本學(xué)位論文就β2-AR激動(dòng)劑克侖特羅(clenbuterol)在新生大鼠心肌細(xì)胞介導(dǎo)的生物效應(yīng)進(jìn)行了研究，由三部分組成：(1)β2-AR激動(dòng)劑克侖特羅對新生大鼠心肌細(xì)胞受磷蛋白磷酸化的作用；(2)β2-AR激動(dòng)劑克侖特羅對心肌細(xì)胞MAPK信號通路的作用及機(jī)制研究；(3)β2-AR激動(dòng)劑克侖特羅對心肌細(xì)胞—氧化氮合成的作用。 第一部分 克侖特羅對新生大鼠心

4、肌細(xì)胞受磷蛋白磷酸化的作用 背景：心肌β-AR被兒茶酚胺激活后可以增加心肌收縮并加快心肌舒張。在成年大鼠心肌細(xì)胞β2AR激活后可通過cAMP-PKA信號途徑促L型鈣通道開放，但對受磷蛋白(phospholamban，PLB)磷酸化沒有影響。推測在新生大鼠心肌細(xì)胞β2AR對PLB的磷酸化作用有可能不同于成年大鼠心肌細(xì)胞。 方法：測定給予克侖特羅后心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和胞內(nèi)cAMP水平變化的時(shí)間曲線。采用Westernblo方法

5、，檢測受磷蛋白在Serine16(Ser16)和Threonine17(Thr17)的磷酸化水平。 結(jié)果：克侖特羅以時(shí)間依賴性方式增加新生大鼠心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率以及細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。克侖特羅還可以時(shí)間-劑量依賴性的方式促進(jìn)受磷蛋白在Ser16位點(diǎn)的磷酸化，該作用可被選擇性β2AR阻斷劑ICI118551和PKA抑制劑Rp-cAMP所阻斷。Gi蛋白抑制劑PTX具有協(xié)同作用，但不顯著。Clenbuterol還可促進(jìn)受磷蛋白在Thr1

6、7位點(diǎn)的磷酸化，并呈時(shí)間依賴性。 結(jié)論：在新生大鼠心肌細(xì)胞β2克侖特羅可促進(jìn)受磷蛋白在Ser16和Thr17位點(diǎn)的磷酸化，可能參與改善心臟舒張功能。 第二部分 克侖特羅對新生大鼠心肌細(xì)胞MAPK信號通路的作用及機(jī)制研究 §1克侖特羅對新生大鼠心肌細(xì)胞ERK1/2的作用及機(jī)制研究 背景：G蛋白偶聯(lián)受體可通過Gi蛋白激活胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedk

7、inase1/2，ERK1/2)。在不同細(xì)胞胞內(nèi)cAMP積聚可增加或減少ERK1/2的活性。鈣動(dòng)員也參與ERK1/2的磷酸化和去磷酸化的調(diào)節(jié)。在成年大鼠心肌細(xì)胞β2AR可通過Gi蛋白信號途徑磷酸化ERK1/2。而β2AR可促進(jìn)新生大鼠心肌細(xì)胞鈣動(dòng)員和cAMP水平增加但對成年大鼠心肌細(xì)胞無作用。故推測β2AR在新生大鼠心肌細(xì)胞對ERK1/2磷酸化的作用不同于成年大鼠心肌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)擬觀察β2AR對新生大鼠心肌細(xì)胞ERK1/2的磷酸化作用并

8、闡明其機(jī)制。 方法：采用Westernblot方法，檢測經(jīng)與β2AR信號通路有關(guān)的試劑處理的培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞磷酸化ERK1/2蛋白和ERK2總蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：Clenbuterol對新生大鼠心肌細(xì)胞的ERK1/2磷酸化具有雙相作用，表現(xiàn)為給藥后磷酸化水平迅速升高，2min達(dá)到最高值，既而下降，在給藥后30min降至基礎(chǔ)水平的60％。Clenbuterol對ERK1/2的磷酸化和去磷酸化的作用均呈劑量依賴性。細(xì)胞

9、外鈣有無對clenbuterol的促磷酸化作用無影響，但蘭諾丁受體(ryanodinereceptor)激動(dòng)劑ryanodine對此具有協(xié)同作用。而選擇性β2AR激動(dòng)劑ICI118551，百日咳毒素(pertussistoxin，PTX)，鈣螯合劑BAPTA-AM和蘭諾丁受體阻斷劑retheniumred可顯著抑制clenbuterol的促磷酸化作用，而鈣拮抗藥硝苯地平nifedepine的抑制作用不明顯。相反，蛋白磷酸酶抑制劑okad

10、aicacid和鈣泵ATP酶抑制劑thapsigargin均可翻轉(zhuǎn)clenbuterol的去磷酸化作用。蛋白激酶A抑制劑Rp-cAMP也可抑制clenbuterol的去磷酸化作用。Caffeine亦對ERK1/2具有磷酸化和去磷酸化的雙相作用，thapsigargin可阻斷caffeine的去磷酸化作用，而okadaicacid對之無影響。Caffeine和clenbuterol一樣可持續(xù)激活PLB。 結(jié)論：β2受體激活后對新生

11、大鼠心肌細(xì)胞ERK1/2磷酸化具有雙相作用，其中胞內(nèi)鈣動(dòng)員扮演重要角色。Clenbuterol激活ERK1/2與Gi蛋白信號途徑和鈣庫釋放Ca2+有關(guān)，而clenbuterol對ERK1/2的去磷酸化作用則可能與受磷蛋白磷酸化后加快鈣庫攝取Ca2+有關(guān)。 §2克侖特羅對新生大鼠心肌細(xì)胞p38MAPK的作用及機(jī)制研究 背景：文獻(xiàn)報(bào)道p38MAPK可誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡，而在成年大鼠心肌細(xì)胞βAR/Gi通路激活的p38M

12、APK對βAR/Gs信號通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。本論文前部分研究表明clenbuterol通過Gs和Gi蛋白偶聯(lián)對新生大鼠心肌細(xì)胞ERK1/2磷酸化具有雙相作用，而在成年大鼠心肌細(xì)胞僅通過Gi蛋白偶聯(lián)促進(jìn)ERK1/2磷酸化。因此推測clenbuterol對新生大鼠心肌細(xì)胞p38MAPK磷酸化的作用不同于成年大鼠心肌細(xì)胞。 方法：采用Westernblot方法，檢測經(jīng)各種試劑處理后的培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞磷酸化p38MAPK

13、和總p38MAPK蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：Clenbuterol可激活p38MAPK，該作用呈時(shí)間和劑量依賴性，并能被選擇性β2AR阻斷劑ICI118551所抑制；Gi蛋白抑制劑PTX對clenbuterol誘導(dǎo)的p38MAPK磷酸化具有協(xié)同作用，而蛋白激酶A抑制劑Pp-cAMP可阻斷之；鈣通道阻滯藥nifedipine和Ca2+螯合劑BAPTA-AM均可阻斷clenbuterol對p38MAPK的促磷酸化作用。 結(jié)論：在

14、新生大鼠心肌細(xì)胞β2AR激活后可通過Gs/cAMP信號途徑促進(jìn)p38MAPK磷酸化，該作用和細(xì)胞外鈣內(nèi)流增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度有關(guān)。 第三部分 克侖特羅對新生大鼠心肌細(xì)胞一氧化氮合成的作用 背景：一氧化氮(NitricOxide，NO)是調(diào)節(jié)心血管、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要信號分子。NO具有舒張血管，對各種細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞保護(hù)作用等多種生物學(xué)效應(yīng)。血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞在受到內(nèi)毒素和某些細(xì)胞因子刺激后誘生型一氧化

15、氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)表達(dá)增加并釋放大量NO。研究表明，在患有擴(kuò)張型心肌病、缺血性心肌病和其他心血管疾病的患者發(fā)生心力衰竭時(shí)，iNOS基因表達(dá)通常會(huì)增加。 在新生大鼠心肌細(xì)胞，cAMP可增加細(xì)胞因子介導(dǎo)的NO合成。喂食β2AR激動(dòng)劑clenbuterol可誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞合成NO。而本論文第一部分研究表明，clenbuterol可顯著增加新生大鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)cAMP水平

16、。在本實(shí)驗(yàn)中，擬觀察clenbuterol對培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞的NO合成的影響。 方法：采用Griess試劑檢測新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽nitrite的含量，間接反映NO含量。采用Westernblot方法，檢測培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：單獨(dú)給予clenbuterol對于NO合成無任何影響，但能使IL-1β誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的NO顯著增加，此協(xié)同作用呈時(shí)間-劑量依賴性。