溫度調(diào)控球等鞭金藻3011 DHA的積累及其作用機理.pdf

1、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid; DHA)屬于人體必需的ω-3型多不飽和脂肪酸，哺乳動物自身不能合成，必須從食物中攝取以滿足自身的需求。陸地植物DHA含量甚微，而海洋中的魚類或植物中含量豐富，因此海洋的動植物是獲取DHA的理想來源。球等鞭金藻3011屬于海洋中的浮游植物，本身具有合成DHA的能力，同時具有生長快、易調(diào)控的特點，成為研究和調(diào)控DHA的理想實驗材料。本研究通過模擬高等植物逆境脅迫的響應機制，采取溫度

2、調(diào)控的方式，檢測了低溫對細胞膜的通透性和膜電位變化的影響，以確定藻細胞對溫度變化的敏感程度;同時研究了溫度對微藻的抗氧化系統(tǒng)，活性氧積累的影響;并利用RT-qPCR方法，研究低溫對DHA合成途徑中的關(guān)鍵酶表達水平來闡明低溫調(diào)控DHA含量的方法及其作用機制，為微藻源DHA產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。
　　1.細胞通透性變化:用碘化丙啶PI、親脂性陰離子熒光染料DiBAC4(3)、Ca2+敏感型熒光探針Fluo-3/AM標記藻細胞，利用流

3、式細胞儀和倒置熒光顯微鏡檢測溫度調(diào)控對細胞膜通透性、膜電位變化和Ca2+離子通透性的影響。結(jié)果顯示:15-18℃低溫誘導20-24h，可使11.17±1.02％的球等鞭金藻3011細胞內(nèi)熒光強度明顯增強、促使膜的通透性發(fā)生顯著變化（P＜0.05）;同樣誘導條件可使38.17±0.13％的細胞膜電位發(fā)生改變，具有極顯著的變化（P＜0.01）;有58.45±5.59％藻細胞Ca2+通透性發(fā)生劇烈變化與對照組比較均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01

4、)。倒置熒光顯微鏡鏡檢也與該結(jié)果基本一致。說明溫度調(diào)控可以改變細胞通透性，以低溫誘導為主，高溫易誘使細胞破裂。
　　2.細胞抗氧化體系改變:通過15、18、21和24℃溫度調(diào)控，測定球等鞭金藻超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性以及還原型谷胱甘肽(GSH)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量和藻內(nèi)活性氧含量，檢測溫度對球等鞭金藻抗氧化系統(tǒng)和ROS積累與爆發(fā)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在21℃、18℃和1

5、5℃低溫處理下，藻細胞SOD、CAT和POD活性均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢;溫度越低，峰值出現(xiàn)的越早，且峰值越大，同時峰后酶活性下降越快;GSH和MDA含量的變化趨勢與上述酶活性的變化相似;ROS水平隨著溫度的下降而升高，18℃誘導峰值為:14.74±0.58％，與對照組相比具顯著變化(P＜0.05)。
　　3.細胞基因表達量變化:通過設計特異引物序列，對球等鞭金藻3011的脂肪酸去飽和酶基因片段進行篩選，以RT-qPCR技術(shù)檢測基

6、因的相對表達量，探索低溫對多不飽和脂肪酸去飽和酶基因相對表達量的影響。結(jié)果表明:隨溫度的降低酶的表達量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，相對表達量最大值出現(xiàn)在18℃，Des4、Des5、Des6、Des8、Des9和Des12基因最大表達量分別為4.32、9.32、42.57、9.64、73.91以及5.29。
　　4.細胞內(nèi)含物質(zhì)改變:利用尿素包埋的方法并以DHA甲酯作為標樣，氣相檢測DHA含量:經(jīng)18℃低溫誘導24h，藻細胞DHA含量

7、為0.105mg/g，高于對照組2.3倍，比18℃48h含量高出1.14倍。
　　根據(jù)以上結(jié)果說明:球等鞭金藻3011經(jīng)過18℃低溫誘導24h，能夠顯著提高微藻細胞的DHA含量，其作用機制可能是低溫能夠使藻細胞膜發(fā)生去極化，并在去極化的條件下Ca2+通透性發(fā)生改變并活化了NADPH酶，引起自由氧的爆發(fā)，激活細胞的主動防御系統(tǒng)，使微藻細胞一方面通過激活抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性清除多余的ROS，同時ROS作為信號分子，使MAPKs信號通路