大鼠痢疾桿菌感染后PAR-2-AP誘發(fā)的結(jié)腸舒張和腸系膜傳入神經(jīng)敏感性的改變及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:大鼠腸道痢疾桿菌感染對(duì)PAR-2-AP舒張結(jié)腸平滑肌作用的影響及其機(jī)制
　　 目的：PAR-2(Protease-Activated Receptor2)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族,廣泛分布于消化道,參與調(diào)控消化道的運(yùn)動(dòng)、分泌和炎癥反應(yīng)。在腸道急性炎癥期,PAR-2激動(dòng)劑抑制大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用減弱,但炎癥后PAR-2激動(dòng)劑的這種作用是否恢復(fù)到正常還不清楚。在制作腸道感染和炎癥模型時(shí)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都采用化學(xué)物質(zhì)刺激或是寄

2、生蟲感染的方法,而最與臨床接近的大鼠腸道細(xì)菌感染模型鮮見報(bào)道。因此,本研究采用了胃內(nèi)灌注痢疾桿菌的方式制作大鼠腸道感染模型,探討了腸道感染后不同時(shí)間點(diǎn)PAR-2舒張結(jié)腸平滑肌作用的改變及其機(jī)制。
　　 方法：細(xì)菌準(zhǔn)備弗氏志賀痢疾桿菌(Shigella flexneri)由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。
　　 腸炎模型建立：健康雄性Wistar大鼠(200-220 g),隨機(jī)分為對(duì)照組和痢疾桿菌感染組(SF-treated)

3、。實(shí)驗(yàn)前禁食,自由飲水。對(duì)照組給予高壓處理的生理鹽水1 ml灌胃,感染組給予1×108 CFU ml-1痢疾桿菌菌液1 ml灌胃。觀察大鼠腸道感染后大便性狀的改變、進(jìn)食及體重增長情況,并分別于灌胃后第4天、第7天、第11天、第18天、第25天和第35天斷頭處死動(dòng)物,取遠(yuǎn)端結(jié)腸做石蠟切片,HE染色。取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織做MPO測定、肌條張力測定及Western blot檢測。
　　 髓過氧化物酶活性測定：遠(yuǎn)端結(jié)腸組織勻漿后,利用MPO測

4、定試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測結(jié)腸全層組織中MPO活性。HE染色：4％多聚甲醛固定新鮮結(jié)腸標(biāo)本,石蠟包埋,切片厚4μm。常規(guī)脫蠟,水化。蘇木素染色,水洗后鹽酸酒精分化,氨水返藍(lán),伊紅染色,脫水,透明,中性樹膠封片。結(jié)腸離體肌條張力記錄：
　　 肌條制備：斷頭處死大鼠,快速取出2-3 cm遠(yuǎn)端結(jié)腸(距直腸1 cm)置于預(yù)冷的Krebs液中。沿腸系膜剪開腸腔,小心清理腸腔。沿肌纖維走向取結(jié)腸組織,制作縱行肌條和環(huán)形肌條(4m

5、m×10mm)。將肌條分別置于盛有5 ml Krebs液的玻璃浴槽內(nèi),持續(xù)供給95％ O2和5％ CO2并恒溫37℃,每15 min更換一次Krebs液。待肌條自發(fā)收縮穩(wěn)定以后開始實(shí)驗(yàn)。
　　 實(shí)驗(yàn)步驟：加入50μl不同濃度的PAR-2激動(dòng)肽段(PAR-2 activatingpeptide,PAR-2-AP)或無活性的PAR-2反向肽段(PAR-2 reverse peptide,PAR-2-RP),使終濃度為1-10μM,觀

6、察PAR-2激活后結(jié)腸肌條自發(fā)收縮活動(dòng)的改變。觀察阻斷劑TTX的作用時(shí),先加入50μl TTX溶液使終濃度為10μM孵育30 min,再加入不同濃度的PAR-2-AP或PAR-2-RP。
　　 免疫組織化學(xué)：端結(jié)腸冰凍切片用磷酸鹽緩沖液沖洗3次,3％過氧化氫封閉10 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶,PBS沖洗,5％正常兔血清封閉15 min后,滴加羊多克隆抗PAR-2抗體(1:50,50μl)后4℃環(huán)境中孵育過夜,然后用PBS沖洗

7、,加入辣根酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的抗山羊IgG工作液后室溫孵育30 min,用DAB顯色,蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化,氨水返藍(lán),梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。
　　 Western blot：將結(jié)腸組織勻漿后,4℃離心,取上清液進(jìn)行蛋白定量。與sample buffer按照1:1比例混勻,煮沸5 min使蛋白變性。10％SDS-PAGE(sodium dodecylsulfatep

8、olyacrylamide gel)電泳,轉(zhuǎn)膜,室溫下5％脫脂奶粉封閉90 min,加入PAR-2-抗(sc-8205,1:2000)4℃孵育過夜。用TTBS沖洗3次,每次5 min后,在室溫下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:80000)孵育1hr,用TTBS沖洗3次后,ECL顯影。
　　 統(tǒng)計(jì)分析：在離體肌條實(shí)驗(yàn)中,以肌條的平均張力為觀察指標(biāo),加PAR-2-AP或PAR-2-RP之前3 min的平均張力為基礎(chǔ)值,標(biāo)準(zhǔn)化為10

9、0％,加入PAR-2-AP或PAR-2-RP之后不同時(shí)間點(diǎn)的平均張力為效應(yīng)值,效應(yīng)值與基礎(chǔ)值的比值為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。
　　 在western bolt實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組目的蛋白的灰度值標(biāo)準(zhǔn)化為100％,痢疾桿菌處理組目的蛋白的灰度值與對(duì)照組目的蛋白的灰度值之比為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以P<0.05為顯著性差異界值。
　　 結(jié)果：
　　 1.大

10、鼠在痢疾桿菌(1×108 CFU/ml,1 ml)灌胃后第3-4天陸續(xù)開始出現(xiàn)腹瀉、稀便,在7-11天最嚴(yán)重,第18天后消失。HE染色顯示在第4天-11天粘膜水腫,粘膜下中性粒細(xì)胞浸潤。與對(duì)照組相比,感染組大鼠體重增長只在第11天明顯低于對(duì)照組；結(jié)腸組織MPO活性從第7天開始增加,到第11天達(dá)到最高,第18天恢復(fù)正常。
　　 2.PAR-2-AP(1-10μM)抑制大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸縱行肌條和環(huán)形肌條自發(fā)性收縮且有一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系

11、,該抑制效應(yīng)在加入PAR-2-AP2 min內(nèi)最明顯。同樣劑量的PAR-2-RP不影響各肌條的自發(fā)性收縮活動(dòng)。
　　 加入三種濃度(終濃度分別為1,5,10μM)的PAR-2-AP后2 min,遠(yuǎn)端結(jié)腸縱行肌條的張力分別下降8.52±1.37％(P<0.05 vs.RP)、13.77±2.91％(P<0.05vs.RP)和15.27±4.04％(P<0.05 vs.RP),遠(yuǎn)端結(jié)腸環(huán)形肌條的張力分別下降10.29±2.71％(P

12、<0.05 vs.RP)、12.95±3.04％(P<0.05 vs.RP)和16.11±3.93％(P<0.05 vs.RP),加入TTX(10μM)預(yù)處理30 min不影響PAR-2-AP對(duì)結(jié)腸肌條自發(fā)性收縮活動(dòng)的抑制效應(yīng)。
　　 3.大鼠痢疾桿菌感染后結(jié)腸遠(yuǎn)端環(huán)形肌條對(duì)PAR-2-AP舒張作用的敏感性降低,遠(yuǎn)端縱行肌條敏感性沒有明顯改變。
　　 4.免疫組織化學(xué)證實(shí)PAR-2表達(dá)于結(jié)腸的環(huán)形肌、縱行肌以及肌間神經(jīng)叢

13、,痢疾桿菌灌胃后第18天,環(huán)形肌上PAR-2表達(dá)下降。
　　 5.Western blot檢測結(jié)果表明痢疾桿菌感染大鼠后第11-35天遠(yuǎn)端結(jié)腸PAR-2的表達(dá)量降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.痢疾桿菌灌胃可以引起遠(yuǎn)端結(jié)腸的感染和炎癥反應(yīng),遠(yuǎn)端結(jié)腸局部炎癥第11天最明顯,第18天消失
　　 2.PAR-2-AP引起結(jié)腸平滑肌發(fā)生舒張,該效應(yīng)是由平滑肌細(xì)胞上的PAR-2介導(dǎo)的。
　　 3.痢疾桿菌感染

14、大鼠后結(jié)腸遠(yuǎn)端環(huán)形肌對(duì)PAR-2-AP的敏感性降低,這種改變可能與痢疾桿菌感染下調(diào)環(huán)形肌上PAR-2表達(dá)有關(guān)。
　　 第二部分痢疾桿菌感染后空腸腸系膜傳入神經(jīng)敏感性的改變
　　 目的：
　　 腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndorme,IBS)是最常見的功能性腸道疾病,內(nèi)臟高敏感性是IBS的重要臨床表現(xiàn)。部分IBS病人發(fā)病前有腸道感染的病史,這類IBS被稱為感染后IBS(post infect

15、ions IBS,PI-IBS)。目前常用的PI-IBS動(dòng)物模型是用化學(xué)物質(zhì)刺激和寄生蟲感染造成腸道炎癥,本研究擬采用痢疾桿菌灌胃造成大腸炎模型,研究痢疾桿菌感染后空腸腸系膜傳入神經(jīng)對(duì)機(jī)械和化學(xué)刺激敏感性的改變。
　　 方法
　　 1.腸炎模型建立同第一部分,取空腸組織做HE染色和髓過氧化物酶活性測定,方法同第一部分
　　 2.腸系膜傳入神經(jīng)放電記錄技術(shù)
　　 4.實(shí)驗(yàn)步驟
　　 結(jié)果：
　

16、　 1.空腸段腸系膜傳入神經(jīng)呈現(xiàn)規(guī)律的自發(fā)放電,平均放電頻率為8±2 spikes/sec。
　　 2.痢疾桿菌灌胃處理后不同時(shí)間點(diǎn)空腸段沒有觀察到炎癥反應(yīng),與對(duì)照組大鼠相比,SF-treated組大鼠空腸髓過氧化物酶活性沒有明顯改變。
　　 3.灌流液中加入5-HT后,正常和痢疾桿菌感染大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)放電都明顯增加；與對(duì)照組相比,灌胃處理后第25天,大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)電活動(dòng)對(duì)5-HT的反應(yīng)性沒有明顯改

17、變。
　　 4.機(jī)械擴(kuò)張刺激引起正常和痢疾桿菌灌胃大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)放電明顯增加；與對(duì)照組相比,在痢疾桿菌灌胃處理后第25天,空腸段腸系膜傳入神經(jīng)對(duì)機(jī)械擴(kuò)張刺激的敏感性增加。
　　 5.緩激肽興奮正常和痢疾桿菌灌胃大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電活動(dòng),與對(duì)照組相比,在痢疾桿菌灌胃處理后第25天,大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)對(duì)緩激肽刺激的敏感性明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 痢疾桿菌灌胃處理后第25天,空