功能性ghrelin受體在內(nèi)臟迷走和脊髓傳入神經(jīng)通路中的表達(dá).pdf

1、目的：揭示功能性Ghrelin受體(GHS-R la)存在于支配大鼠胃腸道運動的迷走及脊髓內(nèi)臟傳入神經(jīng)通路中以及探討ghrelin是否參與這一通路的功能調(diào)節(jié)。 實驗設(shè)計及方法：為了探討功能性Ghrelin受體(OHS-RIa)在迷走結(jié)狀神經(jīng)節(jié)(NG, nodose ganglion)及脊髓內(nèi)臟傳入神經(jīng)通路背根神經(jīng)節(jié)(DRG,dorsal rootganglia)中的存在及表達(dá)，我們采用原位雜交，免疫組織化學(xué)熒光染色及激光共聚焦顯

2、微鏡成像等技術(shù)，從mRNA和蛋白表達(dá)等角度觀察了GHS-Rla在NG，DRG神經(jīng)元及衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(SGC)中的存在。為了識別此受體在有神經(jīng)纖維投射到胃的脊髓傳入神經(jīng)DRG中的分布，我們應(yīng)用神經(jīng)逆行追蹤技術(shù)，首先將示蹤物熒光金(Fluor-gold，F(xiàn)G)注射到大鼠手術(shù)暴露的胃壁，5天后將DRG取出，然后用三重，即GHS-Rla抗體，CGRP(降鈣素基因相關(guān)肽)抗體及熒光金染色，來識別存在于內(nèi)臟投射神經(jīng)中的功能性Ghrelin受體。為了闡

3、明Ghrelin及Ghrelin受體在胃腸與大腦之間信息傳遞中的具體功能，即ghrelin能否激活脊髓內(nèi)臟傳入通路中的感覺受體，我們使用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)在室溫下(20℃)記錄了從新生大鼠(2-14天)中急性分離的DRG神經(jīng)元細(xì)胞體及衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(SGC)胞內(nèi)的Ca<'2+>濃度。通過灌注包括ghrelin， ghrelin擬似劑GHRP-6以及ghrelin拮抗劑(D-Lys3)-GHRP-6等在內(nèi)的不同的藥劑研究了Ghre

4、lin受體的激活情況。 結(jié)果：(1)應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)(GHS-R la與CGRP)及原位雜交從蛋白及mRNA水平證實了GHS-R la存在于大鼠迷走傳入神經(jīng)通路NG及脊髓內(nèi)臟通路DRG的神經(jīng)元與衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞中。 (2)應(yīng)用免疫雙標(biāo)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在背根神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中都有一些GHS-Rla免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元同時CGRP染色呈顯陽性，顯示GHS-R la和CGRP共存于同一神經(jīng)原中的現(xiàn)象，表明內(nèi)臟傳入神經(jīng)元存在于許多亞核群，同

5、時也進(jìn)一步提示大鼠胃中g(shù)hrelin的表達(dá)和內(nèi)臟傳入神經(jīng)中降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的表達(dá)可能是關(guān)聯(lián)的。 (3)應(yīng)用熒光金(Fluorogold)標(biāo)記的神經(jīng)逆行追蹤技術(shù)從胃追蹤到背根神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)一些表達(dá)CGRP的GHS-Rla免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元也被熒光金染色。 (4)DRG胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)動態(tài)變化的LSCM測定：持續(xù)給予生長激素釋放肽-6(GHRP-6；10<'-

6、6>M：)30-60秒，有55％的神經(jīng)元(52/95;18個神經(jīng)節(jié))產(chǎn)生迅速(平均延滯期為11秒)而短暫的胞內(nèi)ca<'2+>濃度增加。在測定的濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)幅度不依賴于GHRP-6的濃度(10<'-12>-10<'-5>M)變化，而以平均相對熒光強(qiáng)度 (RF) 來表示，其值為1.1 6±0.1 5RF(mean±SD)，相當(dāng)于神經(jīng)元對KC1灌流反應(yīng)幅度的43％。幾乎所有的(91％)活衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(SGC)都對GHRP-6有反應(yīng)，反應(yīng)延

7、滯期為11秒，幅度的平均相對熒光強(qiáng)度為1.62±0.38RF，相當(dāng)于對KC1灌流反應(yīng)幅度的103±59％。對GHRP-6發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞百分率作S型量效反應(yīng)關(guān)系曲線(10<'-14>-10<'->5M)該曲線顯示DRG神經(jīng)元和SGC的EC<,50>均為10<'-11>M。有趣的是從外周神經(jīng)節(jié)中得到的這個EC50和以前報道的ghrelin引發(fā)下丘腦弓狀核神經(jīng)元鋒電位及胞內(nèi)Ca<'2+>濃度變化的EC50也是一致的。持續(xù)灌流gherlin(r

8、at)引起大鼠DRG神經(jīng)元及SGC反應(yīng)的EC<,50>也為10<'-11>M，即與對GHRP-6的反應(yīng)的EC<,50>一致。正如所預(yù)期的一樣，ghrelin無功能的同源異構(gòu)體(Des-octanoyl)-Gherki n(human， 10<'-10>-10<'-7>M)并不能引起[Ca2+]i的增加。但是持續(xù)灌流Ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)-GHRP-6(10<'-6>to 10<'-12>M)30秒?yún)s能夠引起DRG神經(jīng)元

9、細(xì)胞體及SGC[Ca2+]i增加，因此在此實驗中并沒有觀察到它對Ghrelin的拮抗作用。 結(jié)論：這些結(jié)果不但證實了GHS-Rla在大鼠迷走傳入神經(jīng)通路NG中的表達(dá)，而且首次表明脊髓傳入神經(jīng)通路DRG 中的神經(jīng)細(xì)胞及衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞有功能性ghrelin受體的存在，并進(jìn)一步揭示相當(dāng)于生理劑量的ghrelin(≥10<'-10>M)對這兩種細(xì)胞有興奮作用。這些發(fā)現(xiàn)支持了衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的化學(xué)感受效應(yīng)并且同時也預(yù)示了ghrelin對內(nèi)臟脊髓