大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、自然界中很多植物病毒病都是通過(guò)蚜蟲(chóng)進(jìn)行傳播，每年遭到攜毒蚜蟲(chóng)侵染作物的產(chǎn)量都會(huì)發(fā)生不同比例的下降，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了重大的傷害。通過(guò)研究蚜傳植物病毒的分子生物學(xué)機(jī)制能夠?yàn)榉乐窝羵髦参锊《静≌业叫碌姆较蚝退悸贰Ｑ料x(chóng)內(nèi)共生菌GroEL蛋白與蚜傳植物病毒的關(guān)系非常密切，從而受到廣泛關(guān)注。本研究以目前栽培大豆的主要害蟲(chóng)大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)設(shè)計(jì)的特異性引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)大豆蚜（Aphis glycines）和茄無(wú)網(wǎng)蚜（Acyrt

2、h osiphon sola ni）內(nèi)共生菌GroEL進(jìn)行基因的克隆、原核表達(dá)、western blot及目的蛋白純化等相關(guān)試驗(yàn)，驗(yàn)證大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜傳播大豆花葉病毒病的分子機(jī)制:
　　(1)從黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)習(xí)基地采集的大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜，在室內(nèi)恒溫光照培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)接飼養(yǎng)擴(kuò)繁。克隆了大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因，對(duì)序列全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，并與相關(guān)同源基因的核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比。大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因

3、(GenBank登錄號(hào)分別為KJ543522和KJ543523)，序列全長(zhǎng)均為1647bP，由548個(gè)氨基酸組成。通過(guò)與不同昆蟲(chóng)內(nèi)共生菌GroEL基因進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因親緣關(guān)系與不同的地理種群相關(guān)。
　　(2)將克隆的大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因與pET-21b連接之后轉(zhuǎn)移到含有BL21-DE3的E.coli中，構(gòu)建了含2個(gè)目的基因的宿主細(xì)胞表達(dá)載體:AgGroEL和AsGroEL，經(jīng)1

4、2h培養(yǎng)后挑取菌斑，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，進(jìn)行單、雙酶切及測(cè)序的鑒定。SDS-PAGE檢查表達(dá)結(jié)果:載體pETAG和pETAS在10℃、25℃、37℃，經(jīng)200rmp條件下、濃度為0.8mM/ml的IPTG誘導(dǎo)4h條件下，2個(gè)載體均可表達(dá)出69kD的目的蛋白，且溫度越低，表達(dá)量越高。結(jié)果說(shuō)明大豆蚜與茄無(wú)網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因分別在原核表達(dá)載體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了該蛋白的在宿主細(xì)胞外的表達(dá)，為系統(tǒng)研究蚜傳播植物病毒病提供理論的依據(jù)。