大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因克隆及表達分析.pdf

1、自然界中很多植物病毒病都是通過蚜蟲進行傳播，每年遭到攜毒蚜蟲侵染作物的產(chǎn)量都會發(fā)生不同比例的下降，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了重大的傷害。通過研究蚜傳植物病毒的分子生物學機制能夠為防治蚜傳植物病毒病找到新的方向和思路。蚜蟲內(nèi)共生菌GroEL蛋白與蚜傳植物病毒的關系非常密切，從而受到廣泛關注。本研究以目前栽培大豆的主要害蟲大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜為試驗對象，通過設計的特異性引物，利用PCR擴增技術對大豆蚜（Aphis glycines）和茄無網(wǎng)蚜（Acyrt

2、h osiphon sola ni）內(nèi)共生菌GroEL進行基因的克隆、原核表達、western blot及目的蛋白純化等相關試驗，驗證大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜傳播大豆花葉病毒病的分子機制:
　　(1)從黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學香坊實習基地采集的大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜，在室內(nèi)恒溫光照培養(yǎng)箱轉接飼養(yǎng)擴繁。克隆了大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因，對序列全長進行測定，并與相關同源基因的核苷酸序列進行對比。大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因

3、(GenBank登錄號分別為KJ543522和KJ543523)，序列全長均為1647bP，由548個氨基酸組成。通過與不同昆蟲內(nèi)共生菌GroEL基因進行對比發(fā)現(xiàn)，大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因親緣關系與不同的地理種群相關。
　　(2)將克隆的大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因與pET-21b連接之后轉移到含有BL21-DE3的E.coli中，構建了含2個目的基因的宿主細胞表達載體:AgGroEL和AsGroEL，經(jīng)1

4、2h培養(yǎng)后挑取菌斑，進行菌液PCR擴增，提取質粒，進行單、雙酶切及測序的鑒定。SDS-PAGE檢查表達結果:載體pETAG和pETAS在10℃、25℃、37℃，經(jīng)200rmp條件下、濃度為0.8mM/ml的IPTG誘導4h條件下，2個載體均可表達出69kD的目的蛋白，且溫度越低，表達量越高。結果說明大豆蚜與茄無網(wǎng)蚜內(nèi)共生菌GroEL基因分別在原核表達載體內(nèi)實現(xiàn)了該蛋白的在宿主細胞外的表達，為系統(tǒng)研究蚜傳播植物病毒病提供理論的依據(jù)。