大豆蚜熱休克蛋白70基因的克隆、原核表達(dá)與定量分析.pdf

1、熱休克蛋白Hsps(Heat shock proteins)是一類極度保守的應(yīng)激蛋白，廣泛地參與細(xì)胞的保護(hù)。目前，Hsp70家族被廣泛認(rèn)為是最為保守和重要的熱休克蛋白家族。在脅迫環(huán)境下，如重金屬、低氧、高溫、饑餓、病原的入侵等的刺激下，Hsp70的表達(dá)量顯著增加。熱休克蛋白的高度表達(dá)能增強(qiáng)昆蟲(chóng)對(duì)外界脅迫因子的抵御能力，對(duì)昆蟲(chóng)機(jī)體維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和正常新陳代謝有著非常重要的作用。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)使害蟲(chóng)熱休克蛋白的表達(dá)量降低，來(lái)減弱有

2、害昆蟲(chóng)對(duì)外界不利環(huán)境的防御能力，從而達(dá)到協(xié)助殺滅害蟲(chóng)的目的。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)使害蟲(chóng)熱休克蛋白的表達(dá)量降低，來(lái)減弱有害昆蟲(chóng)對(duì)外界不利環(huán)境的防御能力，從而達(dá)到協(xié)助殺滅害蟲(chóng)的目的。
　　 大豆蚜(Aphis glycines Matsumura)屬于半翅目(Hemiptera)、同翅類(Homoptera)、蚜科(Aphididae)、蚜屬(Aphis)，是危害栽培大豆(Glycine max)最為主要的害蟲(chóng)之一，極大影響著大豆的品

3、質(zhì)和產(chǎn)量。目前，國(guó)內(nèi)外尚未專門(mén)針對(duì)Hsp70蛋白對(duì)大豆蚜進(jìn)行防治研究。本文通過(guò)RT-PCR及RACE技術(shù)克隆得到大豆蚜熱休克蛋白70基因（Hsp70與Hsc70），成功構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)，獲得大豆蚜Hsp70重組蛋白。并單頭提取各溫度熱激條件下的大豆蚜RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。為今后研究大豆蚜在受到熱脅迫后熱休克蛋白70的表達(dá)規(guī)律及熱控技術(shù)防治害蟲(chóng)提供依據(jù)。
　　 本研究以大豆蚜{Aphis glycines

4、Matsumura)為材料，分別提取總RNA，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，分別擴(kuò)增得到大豆蚜的Hsp70基因與Hsc70基因的全長(zhǎng)cDNA序列。并利用大腸桿菌pET21b表達(dá)系統(tǒng)對(duì)二者進(jìn)行了原核表達(dá)，得到重組融合蛋白。
　　 本研究克隆了大豆蚜Hsc70 cDNA的全長(zhǎng)的序列:這個(gè)序列含2281個(gè)堿基，其內(nèi)部包含一個(gè)1965個(gè)堿基的開(kāi)放閱讀框，能夠編碼一個(gè)含654個(gè)氨基酸殘基的蛋白，分子量大小為71.41kDa，等電點(diǎn)pI:

5、5.22。大豆蚜Hsc70基因含兩個(gè)典型的Hsp70家族的簽名序列:1DLGTTYS（11～18殘基）殘基，IFDLGGGTFDVSIL（199～212殘基）。推導(dǎo)的氨基酸序列中存在6個(gè)N位糖基化位點(diǎn)。利用SignalP4.0 Server軟件分析后，結(jié)果表明:ORF核苷酸序列內(nèi)的18～19位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)。在GenBank上大豆蚜登錄Hsc70的基因序列，獲得登錄號(hào): KF052087。
　　 克隆了大豆蚜Hsp70 cDN

6、A全長(zhǎng)序列:這個(gè)序列含2268個(gè)堿基，其中包括一個(gè)1962個(gè)堿基的開(kāi)放閱讀框，能夠編碼一個(gè)含653個(gè)氨基酸殘基的蛋白，分子量大小為71.22 kDa，等電點(diǎn)pI:5.43。大豆蚜Hsp70基因含三個(gè)Hsp70家族的簽名序列:IDLGTTYS（10～17殘基），IFDLGGGTFDVSIL（198～211殘基），IVLVGGSTRIPK（335～349殘基）。推導(dǎo)的氨基酸序列中存在6個(gè)N位糖基化位點(diǎn)。利用SignalP4.0 Server

7、軟件分析后，結(jié)果表明:ORF核苷酸序列內(nèi)的17～18位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)。在GenBank上大豆蚜登錄Hsp70的基因序列，獲得登錄號(hào):JQ340173。
　　 研究結(jié)果表明:大豆蚜Hsp70與Hsc70基因均含20種相同種類氨基酸，且各類氨基酸含量基本相同，均富含甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、賴氨酸Lys。昆蟲(chóng)熱休克蛋白Hsp70作為一種糖蛋白，糖基化是酶活化的重要因素之一。利用NetOGlyc2.0軟件發(fā)現(xiàn)在大豆蚜Hsp70氨基

8、酸序列和Hsc70氨基酸序列中均有6個(gè)糖基化位點(diǎn)，除N-位糖基化位點(diǎn)以外，昆蟲(chóng)熱休克蛋白Hsp70的氨基酸序列內(nèi)含有很多硫酸化與磷酸化的位點(diǎn)，利用Expasy分子生物學(xué)服務(wù)器上的Prosite軟件能夠找到這些硫酸化與磷酸化位點(diǎn)，蛋白功能的發(fā)揮受到這些位點(diǎn)的調(diào)控。
　　 通過(guò)氨基酸序列一致性比較分析，可以明顯的看出，大豆蚜Hsp70/Hsc70與其他昆蟲(chóng)Hsp70基因的氨基酸序列的相似度均在90％以上。
　　 分別重組大豆

9、蚜Hsp70/Hsc70基因至pET21b載體內(nèi)，在聚丙烯酰胺凝膠的電泳檢測(cè)后，都能夠檢測(cè)出目的融合蛋白。經(jīng)Western blot分析后，結(jié)果表明:重組質(zhì)粒pET/Hsp70的原核表達(dá)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，確為大豆蚜Hsp70基因的表達(dá)。
　　 利用Real time PGR技術(shù)，對(duì)不同溫度脅迫下大豆蚜Hsp70與Hsc70表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析表明:大豆蚜在25～37℃范圍內(nèi)，其Hsp70表達(dá)量隨溫度升高而上升，37℃時(shí)達(dá)到