PEg-6000模擬干旱脅迫下小偃麥異附加系SN6306差異表達(dá)基因的篩選.pdf

1、在我國，小麥?zhǔn)侵饕氖澄?，也是食品工業(yè)的主要原料，種植面積及產(chǎn)量僅次于玉米與水稻，居于第三。由于我國小麥的種植地區(qū)大部分分布在干旱、半干旱地區(qū)。因此，挖掘小麥抗旱新基因，選育和推行抗旱性強的小麥品種是促成我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。本研究以小偃麥異附加系SN6306（小麥品種煙農(nóng)15和中間偃麥草雜交所得到的）為研究對象，利用GeneFishing技術(shù)對經(jīng)20％PEG-6000模擬干旱處理后的SN6306上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行篩選。所得結(jié)

2、果如下:
　　(1) SN6306萌發(fā)期抗旱性的鑒定
　　利用SN6306，YN15（不抗旱對照）和洛旱2（抗旱對照））鑒定了SN6306萌發(fā)期和苗期的抗旱性。用去離子水或用20％ PEG6000溶液培養(yǎng)SN6306，YN15和洛旱2號的小麥種子，通過測量根長，芽長和胚芽鞘長以及計算傷害率和抗脅迫系數(shù)，發(fā)現(xiàn)SN6306與其親本YN15相比，抗旱性較強。
　　(2) SN6306苗期抗旱性的鑒定
　　在苗期的抗旱鑒

3、定中，通過計算復(fù)水6天中的小麥各個品種的存活率，得出:SN6306、YN15和洛旱2號的存活率明顯不同，SN6306的存活率最高，洛旱2號的次之，YN15的存活率最低。截止到第6天，SN6306的存活率為52.5％，洛旱2號的存活率為43.13％，YN15的存活率為26.25％。
　　(3) GeneFishing-PCR技術(shù)篩選差異基因
　　利用GeneFishing技術(shù)獲得SN6306干旱誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)或新出現(xiàn)的差異表達(dá)

4、片段(DEGs)111個。經(jīng)過使用Blast2GO軟件，參照大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)了42條與干旱脅迫有關(guān)的差異表達(dá)片段，分別參與光合作用，蛋白質(zhì)的合成與降解，滲透調(diào)節(jié)和活性氧的清除，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，脅迫相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)運和離子平衡等過程。
　　(4)小麥TaXTH基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　在得到的111個差異表達(dá)片段中，其中有一條大小約為600 bp的木葡聚糖轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶基因的一段序列。經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序得到長度為1049bp的cDN

5、A序列和2337bp的DNA序列。TaXTH具有3個外顯子(長度分別為306bp、209bp和421bp)，2個內(nèi)含子（長度分別為170bp和1118bp），包含936bp的開放閱讀框，共編碼311個氨基酸殘基。具有信號肽，相似性比對分析結(jié)果表明該蛋白與小麥的近緣物種二穗短柄草中的同源蛋白一致性達(dá)到79％。TaXTH蛋白含有XET/XTH所具有催化酶觸反應(yīng)的保守基序DEIDFEFLG。
　　(5)小麥TaTPP基因的克隆及功能初步

6、分析
　　在GeneFishing的電泳結(jié)果中，得到大小約553bp小麥海藻糖6-磷酸磷酸酯酶基因的一段序列。經(jīng)克隆測序得到編碼區(qū)長度為1221bp，編碼406個氨基酸。TaTPP不含信號肽，屬于HAD蛋白超家族。TaTPP蛋白質(zhì)序列與其它物種的TPP蛋白質(zhì)具有較高的相似性，并且與山羊草和二穗短柄草具有較近的親緣關(guān)系。采用半定量RT-PCR分析對TaTPP在干旱處理下不同時間點的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明在干旱脅迫下，隨著干旱脅