禾谷孢囊線蟲新效應因子Ha-G20E03基因克隆及用于研究其功能的新模式系統的探索.pdf

1、禾谷孢囊線蟲是世界上廣泛分布的一種重要植物病原，給小麥糧食生產安全造成了嚴重威脅。植物線蟲通過其口針向寄主植物細胞分泌效應子蛋白，從而促進線蟲寄生和引起植物致病。但是迄今為止，有關于禾谷孢囊線蟲效應子分子機制研究還十分膚淺，這主要是因為其研究缺乏一個合適的病害系統。
　　本實驗首先基于轉錄組文庫數據，利用RACE法克隆一個推定效應子基因cDNA全長。該基因全長837bp，其中包含一個585bp的開放閱讀框，編碼194個氨基酸，在N

2、端擁有一個21個氨基酸的信號肽，且不含跨膜結構域。通過BLAST比對發(fā)現，該基因與大豆孢囊線蟲G20E03擁有90％的同源性，因此我們將其命名為Ha-G20E03基因。通過原位雜交實驗，Ha-G20E03基因在禾谷孢囊線蟲食道腺細胞中特異性表達，可能在禾谷孢囊線蟲寄生過程中起到重要作用。
　　為了更好的研究該基因的功能，本實驗選取了二穗短柄草，二倍體小麥2A和2D作為候選的禾本科模式植物，希望建立用來替代小麥來研究禾谷孢囊線蟲和其

3、寄主互作分子機制的模式系統。通過禾谷孢囊線蟲接種實驗，活性氧ROS含量檢測，qRT-PCR，植物根部組織組織學分析，大麥條斑花葉病毒誘導的基因沉默(BSMV-VIGS)在候選禾本科植物上的應用等技術檢測了禾谷孢囊線蟲與3種候選禾本科模式植物的親和性，并對非親和寄主分析可能原因，以及對親和寄主進行了接下來的沉默實驗。研究結果表明:禾谷孢囊線蟲可以侵入到Bd21-3根部，但不能完成其生活史，并發(fā)現這種非親和性并不依賴于禾谷孢囊線蟲種群差異。

4、此外，我們在接種禾谷孢囊線蟲后3天的二穗短柄草根組織中觀測到強烈的ROS迸發(fā)，并發(fā)現在這個時間點有7個第三類氧化酶基因和2個NADPH氧化酶基因表達顯著上調。隨后，我們發(fā)現禾谷孢囊線蟲可以在二倍體小麥2A(G1812)和2D(AL8/78)中正常發(fā)育，完成生活史，且發(fā)育進程、各蟲態(tài)所占比例與對照基本上一致。解剖學結果表明2D中的合胞體細胞稍小，2A中合胞體發(fā)育正常。在孢囊形成上，2A和對照的單株孢囊數相當，而2D的單株孢囊數稍低。在實驗

5、室中，在小麥上建立大麥條斑花葉病毒誘導的基因沉默體系，成功將小麥靶標基因PDS沉默，出現光漂白現象，并確定了沉默效果最好的小麥品種濟麥22作為實驗室今后VIGS相關實驗寄主小麥。在二倍體小麥2A上建立大麥條斑花葉病毒誘導的基因沉默體系仍然在構建中。
　　本研究克隆了Ha-G20E03基因，并明確其在禾谷孢囊線蟲食道腺細胞中特異性表達。本實驗還明確了二穗短柄草是禾谷孢囊線蟲非寄主，無法作為與禾谷孢囊線蟲互作的模式寄主，并認為ROS迸