禾谷孢囊線蟲新效應(yīng)因子Ha-G20E03基因克隆及用于研究其功能的新模式系統(tǒng)的探索.pdf

1、禾谷孢囊線蟲是世界上廣泛分布的一種重要植物病原，給小麥糧食生產(chǎn)安全造成了嚴(yán)重威脅。植物線蟲通過其口針向寄主植物細(xì)胞分泌效應(yīng)子蛋白，從而促進(jìn)線蟲寄生和引起植物致病。但是迄今為止，有關(guān)于禾谷孢囊線蟲效應(yīng)子分子機(jī)制研究還十分膚淺，這主要是因?yàn)槠溲芯咳狈σ粋€(gè)合適的病害系統(tǒng)。
　　本實(shí)驗(yàn)首先基于轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)數(shù)據(jù)，利用RACE法克隆一個(gè)推定效應(yīng)子基因cDNA全長(zhǎng)。該基因全長(zhǎng)837bp，其中包含一個(gè)585bp的開放閱讀框，編碼194個(gè)氨基酸，在N

2、端擁有一個(gè)21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，且不含跨膜結(jié)構(gòu)域。通過BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與大豆孢囊線蟲G20E03擁有90％的同源性，因此我們將其命名為Ha-G20E03基因。通過原位雜交實(shí)驗(yàn)，Ha-G20E03基因在禾谷孢囊線蟲食道腺細(xì)胞中特異性表達(dá)，可能在禾谷孢囊線蟲寄生過程中起到重要作用。
　　為了更好的研究該基因的功能，本實(shí)驗(yàn)選取了二穗短柄草，二倍體小麥2A和2D作為候選的禾本科模式植物，希望建立用來替代小麥來研究禾谷孢囊線蟲和其

3、寄主互作分子機(jī)制的模式系統(tǒng)。通過禾谷孢囊線蟲接種實(shí)驗(yàn)，活性氧ROS含量檢測(cè)，qRT-PCR，植物根部組織組織學(xué)分析，大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默(BSMV-VIGS)在候選禾本科植物上的應(yīng)用等技術(shù)檢測(cè)了禾谷孢囊線蟲與3種候選禾本科模式植物的親和性，并對(duì)非親和寄主分析可能原因，以及對(duì)親和寄主進(jìn)行了接下來的沉默實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明:禾谷孢囊線蟲可以侵入到Bd21-3根部，但不能完成其生活史，并發(fā)現(xiàn)這種非親和性并不依賴于禾谷孢囊線蟲種群差異。

4、此外，我們?cè)诮臃N禾谷孢囊線蟲后3天的二穗短柄草根組織中觀測(cè)到強(qiáng)烈的ROS迸發(fā)，并發(fā)現(xiàn)在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)有7個(gè)第三類氧化酶基因和2個(gè)NADPH氧化酶基因表達(dá)顯著上調(diào)。隨后，我們發(fā)現(xiàn)禾谷孢囊線蟲可以在二倍體小麥2A(G1812)和2D(AL8/78)中正常發(fā)育，完成生活史，且發(fā)育進(jìn)程、各蟲態(tài)所占比例與對(duì)照基本上一致。解剖學(xué)結(jié)果表明2D中的合胞體細(xì)胞稍小，2A中合胞體發(fā)育正常。在孢囊形成上，2A和對(duì)照的單株孢囊數(shù)相當(dāng)，而2D的單株孢囊數(shù)稍低。在實(shí)驗(yàn)

5、室中，在小麥上建立大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系，成功將小麥靶標(biāo)基因PDS沉默，出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，并確定了沉默效果最好的小麥品種濟(jì)麥22作為實(shí)驗(yàn)室今后VIGS相關(guān)實(shí)驗(yàn)寄主小麥。在二倍體小麥2A上建立大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系仍然在構(gòu)建中。
　　本研究克隆了Ha-G20E03基因，并明確其在禾谷孢囊線蟲食道腺細(xì)胞中特異性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還明確了二穗短柄草是禾谷孢囊線蟲非寄主，無法作為與禾谷孢囊線蟲互作的模式寄主，并認(rèn)為ROS迸