鴿毛滴蟲(chóng)粘附蛋白AP65的克隆、鑒定及表面定位.pdf

1、鴿源禽毛滴蟲(chóng)，簡(jiǎn)稱鴿毛滴蟲(chóng)，是一種侵害鴿消化道上段的鞭毛原蟲(chóng)，從而引起鴿毛滴蟲(chóng)病，亦稱為“鴿癀”。鴿毛滴蟲(chóng)可感染所有品種和月齡的鴿子，其中對(duì)幼鴿危害最大。鴿毛滴蟲(chóng)病的特征是在鴿口腔、食道、嗉囊、前胃出現(xiàn)壞死性潰瘍，常造成患鴿呼吸道和上消化道梗阻，妨礙正常呼吸和進(jìn)食，繼而引發(fā)呼吸困難和饑餓，嚴(yán)重時(shí)造成宿主死亡。鴿毛滴蟲(chóng)病是一種全球性疾病，具有高發(fā)性和廣泛流行性。藥物治療鴿毛滴蟲(chóng)病有副作用，而且易產(chǎn)生抗藥蟲(chóng)株。目前，亟需尋找安全有效的治療方

2、法，而致病機(jī)制相關(guān)分子的研究就成為未來(lái)重要的研究方向，具有重要意義。對(duì)粘膜微生物致病菌而言，粘附宿主細(xì)胞是至關(guān)重要的過(guò)程。只有粘附于宿主細(xì)胞，才能進(jìn)行物理?yè)p傷、侵襲等一系列致病過(guò)程。粘附蛋白AP65是一種重要的滴蟲(chóng)毒力基因，在多種粘附蛋白中有突出的作用。鴿毛滴蟲(chóng)作為一種粘膜寄生蟲(chóng)，粘附作用可能是其重要特性，AP65也可能是其重要粘附蛋白。鴿毛滴蟲(chóng)潛在的表面毒力因子的探究，將為鴿毛滴蟲(chóng)致病機(jī)制和基因工程疫苗的研究奠定分子基礎(chǔ)，為有效防止鴿

3、毛滴蟲(chóng)病提供理論依據(jù)。
　　本試驗(yàn)具體分為以下4部分:
　　1.鴿毛滴蟲(chóng)AP65序列的克隆測(cè)序
　　本研究根據(jù)已知的陰道毛滴蟲(chóng)AP65三個(gè)基因型序列設(shè)計(jì)引物，克隆獲得鴿毛滴蟲(chóng)AP65部分序列，結(jié)合5'RACE PCR和3'RACE PCR獲取鴿毛滴蟲(chóng)AP65兩端未知序列。通過(guò)試驗(yàn)和拼接分析獲得兩個(gè)基因型TgAP65-1(1766bp)、TgAP65-2(1759bp)，ORF長(zhǎng)1704bp，編碼567個(gè)AA，上傳至Ge

4、nBank獲得序列號(hào)KJ721787、KJ721788。
　　2.鴿毛滴蟲(chóng)AP65的序列分析
　　對(duì)兩個(gè)基因型進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩者核酸同源性為94.22％，AA同源性達(dá)95.6％，并且差異主要存在于5'端。同時(shí)，對(duì)鴿毛滴蟲(chóng)AP65和陰道毛滴蟲(chóng)AP65各基因型的同源性進(jìn)行了分析，同源性可達(dá)90.0％左右，同陰道毛滴蟲(chóng)蘋(píng)果酸脫氫酶和氫化酶體蘋(píng)果酸酶高同源(80％)。鴿毛滴蟲(chóng)TgAP65-1、TgAP65-2分別編碼一個(gè)大小為6

5、3057.81Da、63042.74Da的蛋白質(zhì)，pI分別為8.15、8.48。通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，并結(jié)合已知陰道毛滴蟲(chóng)AP65結(jié)構(gòu)功能信息比較，我們發(fā)現(xiàn)鴿毛滴蟲(chóng)AP65有短信號(hào)肽、無(wú)GPI、多個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)、兩個(gè)蘋(píng)果酸酶域，分別位于88-278，280-533位置。
　　3.鴿毛滴蟲(chóng)TgAP65-2重組蛋白多克隆抗體的制備
　　構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9.0k-TgAP65-2，并采用氯化鋰轉(zhuǎn)染法將重組

6、質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，并用Ni柱純化。經(jīng)Western-blot鑒定表達(dá)的重組蛋白大小約為65KDa，與理論值相符。將純化后的重組鴿毛滴蟲(chóng)AP65蛋白三次免疫BALB/c小鼠進(jìn)行多克隆抗體的制備。通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定抗鴿毛滴蟲(chóng)AP65抗體的效價(jià)后，將分離的小鼠血清作為多克隆抗體使用。
　　4.鴿毛滴蟲(chóng)自然表達(dá)AP65的鑒定及蟲(chóng)體表面定位
　　裂解蟲(chóng)體進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot對(duì)