紫花苜蓿鋅指蛋白基因的克隆及初步鑒定.pdf

1、利用紫花苜蓿抑制消減雜交cDNA文庫(kù)篩選出一個(gè)與大豆鋅指蛋白同源性高的EST序列。根據(jù)此片段序列設(shè)計(jì)3'端和5'端特異引物，利用3'RACE和5'RACE技術(shù)分別得到865bp和1186bp的片段。通過序列拼接獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA，序列分析其含有一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼的蛋白質(zhì)含有418個(gè)氨基酸。將該氨基酸序列進(jìn)行Blast比較，結(jié)果顯示其與已知植物鋅指蛋白具有高度的同源性，其中與大豆鋅指蛋白同源性高達(dá)93％。說明克隆的基因?yàn)樽匣?/p>

2、苜蓿鋅指蛋白基因，命名為MsZFN,并在Genbank中登陸(EU624138)。
　　 利用pBI121載體，將MsZFN基因構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI-ZFN，轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404中，轉(zhuǎn)化紫花苜蓿和煙草，期望得到MsZFN基因超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。經(jīng)抗生素篩選，得到轉(zhuǎn)化的再生苗。提取再生植株的葉中DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均呈陽(yáng)性，初步證實(shí)所得再生植株是轉(zhuǎn)基因植株。利用pKANNIBAL和pART27載體，構(gòu)建紫花苜蓿鋅

3、指蛋白基因RNAi載體pART-F-R，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過葉片共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，期望得到MsZFN基因低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。經(jīng)抗生素篩選，得到轉(zhuǎn)化的再生苗。提取再生植株的葉中DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分結(jié)果呈陽(yáng)性，初步證實(shí)所得再生植株部分為轉(zhuǎn)基因植株。
　　 通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法分析了MsZFN基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MsZFN基因在葉中表達(dá)量最高，而在根中表達(dá)最弱；該基因能夠快速，短暫受鹽

4、誘導(dǎo)；經(jīng)過黑暗處理的植株，隨著時(shí)間的推移，MsZFN基因的表達(dá)量明顯上升。
　　 將含有完整開放性閱讀框的MsZFN基因片段插入pET-30α(+)構(gòu)建了原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，37℃ IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明全長(zhǎng)基因能高效表達(dá)，為后續(xù)融合蛋白的純化和抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。將含有完整開放性閱讀框的MsZFN基因片段插入pA7-GFP構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)載體MsZFN-GFP，通過基因槍轉(zhuǎn)化洋