陰道毛滴蟲、小鼠LAG1基因啟動子區(qū)分析和陰道毛滴蟲肌動蛋白cDNA克隆、表達.pdf

1、研究目的:(1)克隆并分析小鼠及陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)長壽保障基因LAG1啟動子,為進一步研究在細胞衰老過程中LAG1基因的轉錄調控奠定基礎;(2)克隆陰道毛滴蟲肌動蛋白基因片段,表達及純化肌動蛋白重組蛋白,免疫豚鼠獲得抗血清,為進一步研究肌動蛋白在陰道毛滴蟲體內定位及其在細胞衰老過程中的作用奠定基礎。
　　材料與方法:(1)利用Promoter2.0在線分析軟件(http://www.cbs.d

2、tu.dk/ervices/Promoter/),取LAG1(LASS1)基因起始密碼子上游約3000bp進行分析,根據(jù)分析結果,用PCR技術擴增啟動子區(qū)序列,將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T-Easy載體,并分別亞克隆入熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic及增強型綠色熒光蛋白報告基因載體pEGFP-1,用脂質體介導的方法瞬時轉染EC109細胞,48h后測定熒光素酶表達活性及觀察綠色熒光蛋白的表達情況。(2)應用PCR方法獲得陰道毛滴

3、蟲肌動蛋白基因部分片段,克隆入pGEM-T-Easy載體,并亞克隆入表達載體pET-41a,轉化大腸埃希菌(E.coli)BL21,異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)誘導重組質粒表達,親和層析純化表達產(chǎn)物,Brandford法測定重組蛋白含量并免疫豚鼠,用SDS-PAGE和Western blot進行分析鑒定。
　　結果:(1)通過在線啟動子分析軟件發(fā)現(xiàn)在陰道毛滴蟲

4、LAG1基因5′端-400bp~+50bp區(qū)域內含有啟動子的可能性很大,雖然在轉錄起始點附近缺乏經(jīng)典的TATA,CAAT及 GC保守序列,但檢測到5個GATA-1、七個Oct-1結合位點保守序列。據(jù)此設計了六對引物并構建了六種熒光素酶報告基因表達體系及兩種增強型綠色熒光蛋白報告基因表達體系,其中表達載體pGL3-455(-455bp~+55bp)、pGL3-417(-417bp~+55bp)、pGL3-280(-280bp~+55bp)

5、、pGL3-202(-202bp~+55bp)、pGL3-81(-81bp~+55bp)的熒光素酶表達活性相近,均明顯高于表達載體pGL3-47(-47~+55)熒光素酶表達活性,而pGL3-47表達載體熒光素酶表達活性極低,與陰性對照活性相近,提示-47bp~+55bp區(qū)無啟動子活性。綠色熒光蛋白的表達情況為pEGFP-81(-81bp~+55bp)有明顯的綠色熒光蛋白表達,而pEGFP-47(-47bp~+55bp)和空載體pEGF

6、P-1未見表達。(2)通過在線啟動子分析軟件發(fā)現(xiàn)在小鼠LASS1基因5′端-600bp~+50bp區(qū)域內含啟動子的可能性較大,而且在轉錄起始點附近未發(fā)現(xiàn)保守的TATA盒,CAAT盒及GC盒等典型的啟動子元件,但檢測到兩個SP1結合位點保守序列。兩個SP1結合位點位于轉錄起始點上游-181bp區(qū)域內。據(jù)此設計了三對引物并構建了三種熒光素酶報告基因表達體系及三種增強型綠色熒光蛋白報告基因表達體系,分別為pGL3-501(-501bp~+10

7、6bp)、pGL3-181(-181bp~+106bp)和pGL3-26(+26~+106)及pEGFP-501、 pEGFP-181和pEGFP-26。pGL3-501表達載體與pGL3-181表達載體熒光素酶表達活性相近,而pGL3-26表達載體熒光素酶表達活性極低,與陰性對照活性相近,+26bp~+106bp無啟動子活性。綠色熒光蛋白的表達情況也類似, pEGFP-501和pEGFP-181有明顯的綠色熒光蛋白表達,而pEGFP-

8、26和空載體pEGFP-1無表達活性。(3)肌動蛋白基因的PCR產(chǎn)物片段大小500bp;構建了陰道毛滴蟲肌動蛋白基因重組表達質粒;表達了肌動蛋白重組蛋白;SDS-PAGE顯示分離純化的肌動蛋白重組蛋白為47kDa;Western blot結果表明所獲得抗血清可與肌動蛋白重組蛋白在47kDa及陰道毛滴蟲總蛋白在41kDa處特異性反應。
　　結論:(1)在陰道毛滴蟲LAG1基因5′端-81bp~-47bp區(qū)域含有基因轉錄所必需的基本啟