大葉櫸遺傳多樣性與離體保存研究.pdf

1、本研究通過葉綠體DNA的psbA-trnH、trnM-trnG序列分析以及微衛(wèi)星分子標(biāo)記(SSR)分析，對大葉櫸（Zelkova schneideriana Hand.-Mazz.）遺傳多樣性，遺傳結(jié)構(gòu)，基因流等進(jìn)行了研究。采用種子、莖段、葉片等外植體研究大葉櫸的離體保存技術(shù)，闡述了大葉櫸無菌活體（無菌芽和愈傷組織）的獲取，芽繼代增殖的影響因子，無菌芽和愈傷組織離體保存，單芽生根和組培苗移栽等內(nèi)容。具體結(jié)果如下:
　　1.大葉櫸遺

2、傳多樣性
　　本研究通過對瀕危植物大葉櫸的12個居群144個個體的葉綠體DNA的psbA-trnH和trnM-trnG序列分析發(fā)現(xiàn):大葉櫸在物種水平上具有較高的遺傳多樣性，大葉櫸居群間的遺傳變異大于居群內(nèi)的遺傳變異，居群間基因交流較小，導(dǎo)致居群間存在較大遺傳分化。
　　大葉櫸物種水平的單倍型多樣性（hdT）為0.737，核苷酸多樣性（πT）為5.80×10-4。地區(qū)水平上，中國的遺傳多樣性較高，其次是美國，澳大利亞最低。居群

3、水平，湖南桑植最高，其次為浙江桐鄉(xiāng)，江蘇句容、湖南懷化和湖北武漢最低，均為0。大葉櫸在物種水平上的遺傳多樣性水平較高，究其原因，一、可能是由于其異交的繁殖方式，二、可能由于其祖先具有較廣泛的遺傳分布。
　　大葉櫸群體55.17％遺傳變異發(fā)生在居群間，44.83％的變異發(fā)生在居群內(nèi)。對來自不同國家（中國、美國和澳大利亞）的大葉櫸居群進(jìn)行不分層次AMOVA分析顯示，遺傳變異主要存在于組內(nèi)居群間(71.42％)。大葉櫸群體的遺傳變異主要

4、來自于居群間的差異?；谌~綠體DNA序列數(shù)據(jù)，大葉櫸居群的FST=0.551，在葉綠體水平上，Nm為0.408，表明大葉櫸各居群間基因交流較小，導(dǎo)致居群間存在較大的遺傳分化。而基因交流小，可能和大葉櫸種子散播機制有關(guān)。
　　單倍型H3和H8位于網(wǎng)絡(luò)圖的內(nèi)部，并且和外類群光葉櫸（Zelkova serrata）相連，可能是祖先單倍型。整個Network網(wǎng)絡(luò)圖呈現(xiàn)2個分支，其中單倍型H6，H7，H8，H9在一個分支，其他單倍型聚為另一

5、個分支。單倍型H4廣泛分布于地理距離較遠(yuǎn)的6個居群中，可推測該物種的祖先可能具有較廣泛的遺傳分布。
　　采用雙抑制PCR法開發(fā)出12對大葉櫸SSR引物，用來自江西，安徽，美國的3個居群的55個個體檢測SSR引物的多態(tài)性和3個居群的遺傳多樣性水平。
　　12對引物均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性水平。SSR序列已上傳到GeneBank，登錄號:KJ749829～KJ749840。
　　遺傳多樣性研究結(jié)果表明:江西居群擁有最高的遺傳多

6、樣性水平，其次為安徽居群，遺傳多樣性水平最低的是來自美國的居群。該結(jié)果和葉綠體DNA序列分析結(jié)果一致。
　　2.大葉櫸離體保存研究
　　種子外植體的消毒可不受季節(jié)和天氣的影響，莖段外植體消毒受季節(jié)影響較大。通過無菌播種，種子可直接萌發(fā)獲得無菌芽。從莖段可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生腋芽單芽或者腋芽叢生芽。種子或者幼嫩的葉片可以通過脫分化產(chǎn)生愈傷組織，然后由愈傷組織再分化產(chǎn)生無菌芽。
　　研究不同因素對大葉櫸無菌芽繼代增殖效果的影響。結(jié)

7、果表明:BA對芽的增殖倍數(shù)有顯著影響，木質(zhì)化程度較高的腋芽叢生芽采用WPM+BA4.0 mg/L+KT2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L培養(yǎng)基可獲得較高的增殖率。為避免芽體愈傷化，過于幼嫩的無菌芽在繼代培養(yǎng)的前期，應(yīng)在不添加BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。附加2.0 g/LPVP的培養(yǎng)基能有效抑制組培繼代芽的褐化。
　　較低激素水平的培養(yǎng)基適宜對大葉櫸無菌芽和愈傷組織進(jìn)行離體保存，而適當(dāng)提高激素水平，特別是BA的水平，可以誘導(dǎo)愈傷組織分