大豆黃酮對(duì)仔豬腸道微生物的影響和雌馬酚產(chǎn)生菌的分離及其特性的研究.pdf

1、大豆黃酮作為一種植物雌激素對(duì)人和動(dòng)物的健康和生長有良好促進(jìn)作用,因此開發(fā)利用黃酮類化合物正成為當(dāng)前食品業(yè)與畜牧業(yè)的一個(gè)熱點(diǎn)。許多報(bào)道表明,大豆黃酮的生物活性更多的是由其代謝終產(chǎn)物雌馬酚來實(shí)現(xiàn)的,與大豆黃酮苷元相比,雌馬酚與雌激素受體結(jié)合的親和力、抗氧化活性、抗前列腺癌作用更強(qiáng)。而且雌馬酚在體內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定,不再發(fā)生降解,因此要想充分發(fā)揮大豆黃酮的生物學(xué)作用,必須使其盡可能轉(zhuǎn)化成雌馬酚,但雌馬酚只能由腸道細(xì)菌特異性產(chǎn)生。許多學(xué)者認(rèn)為,大豆黃酮

2、對(duì)動(dòng)物的生理效應(yīng)在很大程度上決定于動(dòng)物自身的腸道微生物菌群,但現(xiàn)有報(bào)道表明只有30-40％的人體內(nèi)定植能夠產(chǎn)生雌馬酚的細(xì)菌,迄今為止,國內(nèi)外有關(guān)大豆黃酮降解菌的研究多集中在人和小鼠上,而且分離獲得的腸道內(nèi)大豆黃酮降解菌只有少數(shù)幾種,這其中的瓶頸在于大豆黃酮降解菌的分離條件(包括厭氧條件與分離培養(yǎng)基等)十分苛刻,如何突破這一瓶頸,大量分離腸道內(nèi)具有降解大豆黃酮能力的微生物,從而全面了解大豆黃酮這一功能性物質(zhì)在腸道內(nèi)的降解過程,以及更深入地

3、闡明大豆異黃酮在體內(nèi)降解和發(fā)揮生理作用的形式,是該領(lǐng)域亟待解決的問題。本研究為闡明上述研究中的部分問題,采用動(dòng)物試驗(yàn)、體外分離培養(yǎng)技術(shù)與分子生物學(xué)手段,研究了大豆黃酮對(duì)仔豬腸道微生物區(qū)系的影響、二花臉豬糞樣菌群對(duì)大豆黃酮的代謝能力；并從低成本篩選的角度入手,獲取了一種可大量富集大豆黃酮降解菌的培養(yǎng)基,在此基礎(chǔ)上,從豬糞樣中分離到數(shù)株降解大豆黃酮產(chǎn)生雌馬酚的菌株,研究了這些降解大豆黃酮產(chǎn)雌馬酚細(xì)菌的生理特性。試驗(yàn)結(jié)果闡明了大豆黃酮對(duì)仔豬腸

4、道微生物區(qū)系的作用效應(yīng),揭示了仔豬腸道內(nèi)產(chǎn)雌馬酚微生物種類及其與宿主間的關(guān)系,同時(shí)也為腸道雌馬酚產(chǎn)生菌的進(jìn)一步研究拓寬了思路。 1 大豆黃酮對(duì)仔豬腸道微生物區(qū)系的影響 選取江蘇某豬場產(chǎn)期相近、胎次相似數(shù)目相當(dāng)?shù)亩?長/大三元雜交仔豬6窩,隨機(jī)分為兩組,每組三窩。一組為對(duì)照組,另一組為處理組,在7、9、11d對(duì)照組每頭豬強(qiáng)飼脫脂乳1 mL、2 mL、3 mL,處理組每頭豬強(qiáng)飼含大豆黃酮(10 mg/L)的脫脂乳1 mL、2

5、 mL、3 mL。兩組均于21d斷奶。于14、21、24、35 d每窩各屠宰一頭,無菌采集十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸食糜。食糜細(xì)菌16S rRNA基因序列的V6-V8可變區(qū)經(jīng)PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DGGE電泳后再進(jìn)行多樣性分析,并對(duì)特殊條帶進(jìn)一步克隆測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂大豆黃酮后,處理組仔豬各腸段的DGGE條帶數(shù)均高于對(duì)照組,盲腸、結(jié)腸和直腸中細(xì)菌的多樣性指數(shù)增加；對(duì)照組中出現(xiàn)的3條優(yōu)勢條帶在處理組中消失,經(jīng)克隆測序后與Gen

6、BanK登錄序列比較,發(fā)現(xiàn)它們分別與Clostridium thermocellum,Lactonacillus pontis,Streptococcus sp.最相似。與對(duì)照組相比,在35d時(shí)處理組大腸中出現(xiàn)3條優(yōu)勢條帶,經(jīng)克隆測序后與GenBank登錄序列比較,發(fā)現(xiàn)它們分別與Butyrate-producing bacterium SL7/1,Clostridum butyricum(NCIMB8082),Ruminococcus

7、obeum clone 1-4最相似,相似性分別為950％,95％和96％。因此大豆黃酮可使仔豬大腸的微生物區(qū)系多樣性增加,并且可選擇性地促進(jìn)某些菌群的富集。 2 體外培養(yǎng)研究二花臉豬糞樣菌群對(duì)大豆黃酮的降解規(guī)律 通過體外培養(yǎng)研究了不同日齡3窩(A、B、C)二花臉豬的糞樣菌群對(duì)大豆黃酮的降解和雌馬酚的產(chǎn)生規(guī)律。每窩各含1頭母豬和3頭仔豬。通過HPLC測定培養(yǎng)液中大豆黃酮和雌馬酚的含量,并通過DGGE圖譜分析每窩豬的糞樣菌

8、群的變化規(guī)律。結(jié)果表明12頭二花臉豬中有8頭豬的糞樣菌群可將大豆黃酮降解成雌馬酚。在3窩二花臉豬中,A窩母豬糞樣菌群不能代謝大豆黃酮,但在其斷奶后的兩頭仔豬糞樣培養(yǎng)液中檢測到雌馬酚；B窩和C窩母豬糞樣培養(yǎng)液中均檢測到較高含量的雌馬酚,在仔豬糞樣培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)B窩有1頭仔豬,C窩有3頭仔豬均檢測到雌馬酚。通過DGGE指紋圖譜分析,每窩二花臉豬糞樣培養(yǎng)液中可檢測到雌馬酚的豬的糞樣細(xì)菌菌群之間的相似性均大于60％,高于它們與未檢測到雌馬酚的豬的

9、糞樣菌群的相似性。提示,二花臉豬糞樣菌群中存在可降解大豆黃酮產(chǎn)生雌馬酚的微生物。 3 產(chǎn)雌馬酚微生物培養(yǎng)基的篩選及豬糞樣中雌馬酚產(chǎn)生菌的分離與鑒定 為富集仔豬糞樣中能夠代謝大豆黃酮產(chǎn)雌馬酚的微生物,本研究對(duì)三種不同培養(yǎng)基(M1、M2、M3)進(jìn)行了篩選,并在獲得其中一種可富集雌馬酚產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,對(duì)仔豬糞樣中的雌馬酚產(chǎn)生菌進(jìn)行了分離鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),M1培養(yǎng)基中富集的微生物可以降解大豆黃酮產(chǎn)生大量的雌馬酚。進(jìn)一步對(duì)培

10、養(yǎng)基M1中富集的微生物進(jìn)行了分離鑒定,獲得了3株(D1、D2、D3)能夠代謝大豆黃酮產(chǎn)雌馬酚的純菌,通過革蘭氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和進(jìn)一步作生理生化鑒定后發(fā)現(xiàn)D1和D2為Eubacterium屬,D3為Enterococcus faecalis。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,D1與SNU-Julong732位于一個(gè)簇內(nèi),D2與SNU-NiuO16位于同一個(gè)簇內(nèi)。通過體外厭氧培養(yǎng)進(jìn)一步比較了雌馬酚產(chǎn)生菌D1的代謝性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葡萄糖、麥芽糖、

11、果糖、菊粉、乙酸和丁酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基均能促進(jìn)菌株D1生長,其中果寡糖和菊粉比葡萄糖能更好促進(jìn)菌株D1生長,并且添加寡糖組比單糖組能提高D1產(chǎn)雌馬酚的濃度。短鏈脂肪酸乙酸和丁酸不能明顯促進(jìn)D1的生長,但能促進(jìn)其產(chǎn)雌馬酚的濃度；而乳酸對(duì)雌馬酚的產(chǎn)生有抑制作用v以上結(jié)果說明通過該方法篩選的培養(yǎng)基能夠有效的分離可將大豆黃酮轉(zhuǎn)化成雌馬酚的微生物,并且添加寡糖能促進(jìn)雌馬酚的產(chǎn)生。 4 體外繼代培養(yǎng)研究仔豬糞樣大豆黃酮降解菌群的變化規(guī)律

12、 采用體外繼代培養(yǎng)法,結(jié)合PCR-DGGE技術(shù),研究了二花臉仔豬糞樣中大豆黃酮降解菌群的變化規(guī)律,并對(duì)富集培養(yǎng)液中的菌群進(jìn)行了克隆測序。結(jié)果表明,二花臉仔豬糞樣中微生物菌群在體外繼代培養(yǎng)40代后,糞樣菌群仍具有降解大豆黃酮產(chǎn)雌馬酚的能力；PCR-DGGE的分析結(jié)果表明,隨繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加,培養(yǎng)液中微生物區(qū)系的DGGE圖譜上的條帶數(shù)逐漸變少,一些條帶消失,這些條帶編號(hào)為A1,A2,A3,A4和A5,經(jīng)克隆和切膠測序結(jié)果表明,A1與Meg

13、asphaera elsdenii stran YJ-4有91％的相似性,A2與Megasphaera elsdenii strain 5T有99％的相似性,A3與Clostridium Sp.cTPY-17有87％的相似性,A4與Succinivibrio dextrinosolvens有96％的相似性,A5與Bacteroides sp.MANG有94％的相似性。而部分條帶一直存在逐漸成為優(yōu)勢菌群。這些條帶編號(hào)為QE3、QFA、QE

14、7、QE8和QJ7。16SrRNA基因測序結(jié)果表明,QE3與Coporococcus comes strain ATCC 27758有92％的相似性；QE4與Clostridium bacterium JN18_V41_S具有93％的相似性；QE7與Eubacterium callanderi有99％的相似性；QE8與Clostridium glycyrrhizinilyticum有94％的相似性；QJ7與Bifidobacterium

15、 pseudolongum subsp.globosum strain 7＃-3-7有94％的相似性。以上結(jié)果說明,混合糞樣中存在一些難以分離到且在大豆黃酮降解中起重要作用的微生物,同時(shí)添加大豆黃酮可起到體外富集大豆黃酮降解菌作用。 本文通過在體和體外試驗(yàn)研究了大豆黃酮與豬消化道微生物之間的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在在體試驗(yàn)中仔豬飼喂大豆黃酮后,其后腸微生物區(qū)系的多樣性增加,且部分微生物明顯得到富集；體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)二花臉豬糞樣菌群具有降