五個(gè)慢性HBV感染相關(guān)候選基因的SNP篩查及遺傳易感性研究.pdf

1、常見(jiàn)復(fù)雜疾病(腫瘤、高血壓、糖尿病、精神分裂癥、哮喘、自身免疫疾病、感染病等)由許多微效累加基因與環(huán)境因素共同作用而決定,對(duì)于其遺傳易感性的研究,連鎖不平衡-關(guān)聯(lián)研究的統(tǒng)計(jì)效能顯著強(qiáng)于經(jīng)典的家系連鎖分析.免疫組化和分子生物學(xué)研究提示雌激素受體α(ESR1)、雌激素受體(AR)、MHC-Ⅱ反式激活因子(C2TA)、CXCL10和CD209在慢性HBV感染中起作用,但這些基因的多態(tài)性在群體水平與慢性HBV感染的關(guān)系尚未有研究.我們選擇上述5

2、個(gè)基因作為侯選基因,擬在中國(guó)人群中篩查其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)分布及頻率,選擇單倍體標(biāo)簽SNP(htSNP)在慢性HBV感染病例/對(duì)照及核心家系中分型,并對(duì)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)的生物學(xué)功能意義進(jìn)行驗(yàn)證.我們用代表中國(guó)人群的32個(gè)基因組DNA為參考樣本進(jìn)行SNP發(fā)掘.在基于醫(yī)院的樣本收集中,從4112人中篩選出2489名無(wú)親緣關(guān)系的慢性HBV感染者(病例)、自限性恢復(fù)者(對(duì)照)

3、和參考人群,最終確定了1405名慢性HBV感染者和749名自限性恢復(fù)者作為我們研究所用的病例/對(duì)照樣本,74名暴露未感染者和261名獻(xiàn)血員作為參考樣本為了對(duì)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行傳遞不平衡測(cè)試(TDT),另外還收集了315個(gè)慢性HBV感染核心家系(慢性HBV感染者及其父母).提取了研究對(duì)象的基因組DNA,并制作成分型所用DNA模板.針對(duì)5個(gè)基因的5'側(cè)翼(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前約2kb)、編碼區(qū)、5'和3'非編碼區(qū)、內(nèi)含子/外顯子交界及3'側(cè)翼序列設(shè)

4、計(jì)引物.擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約500~600bp,相鄰片段之間重疊120~200bp.PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序,序列峰圖通過(guò)PolyPhred軟件檢讀SNP.個(gè)體基因型數(shù)據(jù)經(jīng)PHASE軟件構(gòu)建單倍型,計(jì)算群體遺傳學(xué)參數(shù)(θ、π、Tajima's D、Fu and Li's D、重組分析等);單倍型數(shù)據(jù)經(jīng)Stata7.0軟件確定單倍型標(biāo)簽SNP;通過(guò)LDA軟件計(jì)算SNP位點(diǎn)之間連鎖不平衡參數(shù)(D'和r<'2>),經(jīng)GOLD軟件繪制連鎖不平衡圖譜,確

5、定連鎖不平衡模塊.選擇有代表性的10個(gè)SNP位點(diǎn),綜合采用PCR-RFLP、擴(kuò)增折射變異位點(diǎn)PCR和直接測(cè)序法在病例對(duì)照進(jìn)行分型和核心家系中進(jìn)行分型.基因型數(shù)據(jù)采用SPSS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行率的比較(χ<'2>檢驗(yàn))和非條件logistic回歸分析.采用TDT/S-TDT program1.1進(jìn)行核心家系傳遞不平衡測(cè)試(TDT).測(cè)序發(fā)掘關(guān)聯(lián)位點(diǎn)兩側(cè)基因組區(qū)域的SNP(每隔30~40kb),采用LDA和GOLD軟件分析兩側(cè)區(qū)域的LD關(guān)系