Paget骨病家系相關基因篩查及候選基因功能研究.pdf

1、Paget骨病是一種慢性進行性的代謝性骨病，以過度紊亂的骨更新為特征，可引起骨痛、骨畸形、導致病理性骨折及其他并發(fā)癥，病變可累及全身一處或多處骨骼，以中軸骨和承重的四肢骨多見。病灶處發(fā)現(xiàn)巨大多核的破骨細胞增多，且活性增強。Paget骨病分為散發(fā)性和家族性，在西歐、北美等地區(qū)多見。該病的發(fā)病機制還未完全清楚，普遍認為環(huán)境因素與遺傳因素共同影響該疾病的發(fā)生。在新西蘭、澳大利亞和南非等國家中，來自高患病率地區(qū)的移民Paget骨病患病率明顯高于

2、本地人。Paget骨病患病率在種族上的差異性及家族性聚集性提示遺傳因素在其發(fā)病機制中有重要作用。Paget骨病患者往往有陽性家族史，通常呈常染色體顯性遺傳，不完全外顯率較高。近年來，隨著分子遺傳學技術的不斷發(fā)展，人們對Paget骨病遺傳病因的研究不斷深入。新近研究發(fā)現(xiàn)，RANK/RANKL和NF-kB信號通路分子如SQSTM1/p62等基因突變與破骨細胞的異?；罨癙aget骨病的發(fā)生有關，但半數(shù)以上的該病患者未發(fā)現(xiàn)這些突變，提示其他基

3、因變異可能參與其發(fā)生發(fā)展。
　　 目的：
　　 在對Paget骨病家系進行已知易感基因檢測的基礎上，利用全基因外顯子測序技術篩查相關基因突變，并對篩查的疾病候選基因ASB16及FKBP5基因進行功能研究，探討其在Paget骨病發(fā)病的作用，為深入了解其發(fā)病的遺傳學機制奠定基礎。
　　 方法：
　　 1.SQSTM1及TNFRSF11A基因突變篩查:抽取家系成員外周血并提取全血基因組DNA，通過查閱文獻確定S

4、QSTM1及TNFRSF11A為該Paget骨病家系的基因篩查的候選基因，針對兩個基因的全部外顯子分別設計引物，PCR擴增，對擴增產物直接DNA測序，結果用軟件Sequencher5.0 Demo分析。
　　 2.ASB16基因啟動子活性的研究:通過對患者全基因外顯子測序，發(fā)現(xiàn)ASB16基因5'端+27處G/C雜合性變異。通過對正常樣本測序篩查，統(tǒng)計ASB16基因待測位點在正常人群中基因型分布頻率。應用啟動子預測軟件確定包括該變

5、異位點的候選啟動子區(qū)域，經PCR擴增活得該啟動子基因片段，將基因片段插入pMD-18T克隆載體，構建重組克隆質粒pMD-18T/ASB16，通過菌落PCR鑒定陽性克隆，通過DNA測序篩選突變型和野生型陽性克隆質粒。構建熒光素酶報告基因載體pGL3/ASB16，NheⅠ，HindⅢ雙酶切pMD-18T/ASB16克隆載體，將切下回收ASB16基因啟動子片段插入質粒pGL3-basic中。在脂質體的作用下，將重組的熒光素酶報告基因質粒pGL

6、3/ASB16與內參照質粒pRL-TK共轉染真核細胞HEK293，培養(yǎng)48小時后，通過檢測熒光素酶活性反應啟動子活性，結果用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0分析。
　　 3.人FKBP5基因的克隆表達及純化:通過對患者全基因外顯子測序，在FKBP5基因中發(fā)現(xiàn)G/C雜合性變異。為研究該突變對FKBP5功能的影響極其在Paget骨病發(fā)病中的作用，進行野生型和突變型FKBP5表達的研究。針對目的基因片段設計引物，并加入NcoⅠ和BamHⅠ酶

7、切位點，C端加入6×His的His-Tag標簽。通過PCR擴增獲得野生型和突變型的目的基因片段，插入pMD-18T克隆載體，構建野生型及突變型的重組克隆質粒pMD-18T/FKBP5，菌落PCR篩選陽性克隆，并DNA測序分析鑒定。分別構建野生型及突變型的pET-11 d/FKBP5原核表達載體，重組克隆質粒pMD-18T/FKBP5經NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切，將瓊脂糖凝膠電泳分離純化的FKBP5基因片段插入雙酶切后的原核表達載體pET

8、-11d中，轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR及酶切分析鑒定重組表達質粒。分別將野生型和突變型的重組質粒pET-11 d/FKBP5轉化BL21感受態(tài)菌株，挑取單克隆菌落培養(yǎng)至對數(shù)期，經IPTG誘導后，SDS-PAGE分析和Western blot鑒定重組蛋白。重組人FKBP5蛋白的純化，誘導表達的重組人FKBP5分別收集菌裂解上清和包涵體沉淀，做SDS-PAGE分析蛋白表達形式，在非變性條件下，采用Ni2+-NTA親和層析法對目的蛋白進

9、行純化，做SDS-PAGE分析目的蛋白的純度。
　　 結果：
　　 1.SQSTM1及TNFRSF11A基因突變篩查
　　 在該家系中未發(fā)現(xiàn)與Paget骨病共分離的致病基因突變，檢測到14個已知的單核苷酸多態(tài)性。提示SQSTM1及TNFRSF11A不是該家系的致病基因。
　　 2.ASB16基因啟動子活性的研究
　　 2.1正常人群ASB16突變率的研究:正常樣本篩查結果ASB16基因待測位點基因

10、型GC頻率2.74％，基因型GG頻率97.26％，提示該變異為新發(fā)現(xiàn)的SNP。
　　 2.2熒光素酶報告基因載體的構建:PCR擴增的ASB16基因候選啟動子片段，電泳可見463bp處有明亮條帶，與設計一致。將ASB16基因候選啟動子片段與線性克隆載體pMD-18T連接后，轉化DH5α，經菌落PCR篩選及DNA測序鑒定，成功獲得了野生型及突變型的克隆載體pMD-18T/ASB16。分別將野生型和突變型ASB16基因候選啟動子基因片

11、段插入熒光素酶報告基因載體pGL3-basic中，通過PCR和DNA測序鑒定正確，成功構建了野生型和突變型的熒光素酶報告基因載體pGL3/ASB16。
　　 2.3啟動子活性檢測:熒光素酶活性檢測，與陰性對照組相比，重組的熒光素酶報告基因載體pGL3/ASB16熒光素酶活性升高(P＜0.05);野生型與突變型pGL3/ASB16相比，熒光素酶活性無顯著差異（P＞0.05）。提示該突變不影響ASB16啟動子的活性，不是該家系致病基

12、因。
　　 3.人FKBP5基因的克隆表達及純化
　　 3.1表達載體的構建:PCR擴增的野生型及突變型FKBP5基因片段，電泳可見1400bp處有明亮條帶，與設計一致。分別將FKBP5基因片段與線性克隆載體pMD-18T連接后，轉化DH5α，經菌落PCR篩選及DNA測序鑒定，成功獲得了野生型及突變型的克隆載體pMD-18T/FKBP5。通過NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切克隆載體pMD-18T/FKBP5，將FKBP5基因片

13、段插入原核表達載體pET-11d中，并通過雙酶切和菌落PCR鑒定正確，成功構建了野生型和突變型原核表達載體pET-11 d/FKBP5。
　　 3.2人FKBP5蛋白的表達鑒定及純化:野生型和突變型菌株經擴增、IPTG誘導，SDS-PAGE分析，誘導后的重組菌株在52kD處出現(xiàn)明顯目的條帶，并且目的蛋白大部分以可溶性形式表達于菌體的超聲上清中。Western blot結果顯示重組蛋白與抗人FKBP5多克隆抗體和抗His-Tag單

14、克隆抗體均能發(fā)生特異性結合，表明獲得的重組蛋白為特異性FKBP5蛋白。非變性條件下，采用Ni2+-NTA親和層析法對目的蛋白進行純化，進行SDS-PAGE分析，F(xiàn)KBP5蛋白純度達到85％以上。
　　 結論：
　　 1.SQSTM1及TNFRSF11A不是該家系的致病基因:SQSTM1及TNFRSF11A的基因突變篩查中，在該家系中未發(fā)現(xiàn)與Paget骨病共分離的致病基因突變，檢測到14個已知的單核苷酸多態(tài)性，排除這兩個基

15、因為該家系Paget骨病致病基因的可能性。
　　 2.ASB16基因上游新發(fā)現(xiàn)的SNP與該家系的發(fā)病無關:成功構建了野生型和突變型的熒光素酶報告基因載體pGL3/ASB16，ASB16基因候選啟動子有一定的啟動活性，野生型與突變型啟動活性無明顯差異，該位點的變異對ASB16基因的啟動活性無顯著影響，提示新發(fā)現(xiàn)的SNP和Paget病的發(fā)病無關。
　　 3.人FKBP5蛋白的表達純化:成功構建了野生型和突變型的人FKBP5基