輸血前血液篩查中新型HBV基因突變及抗原分析的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 輸血是挽救人類生命的重要手段，輸血前對血液進行一系列生物學篩查和安全性評價，對保障安全用血和生命健康具有重要意義。目前我國輸血前血液篩查大多仍采用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測血液中的病原生物及其成分。近年來隨著檢測試劑盒靈敏度的不斷提高，經(jīng)輸血傳播病原微生物的危險性已經(jīng)處于較低水平。然而，由于病毒感染者“窗口期”獻血、隱匿性感染現(xiàn)象與病毒變異的存在，病毒反應性（陽性）獻血者的漏檢問題依然存在，

2、輸血或輸注血液制品仍有一定的傳播病毒的殘余風險，對接受輸血者的生命安全造成極大危害。因此探索新的血液篩查方法，采用更加敏感特異方法消除漏檢，對于增強輸血及血液制品安全性具有重要的實際意義。
　　 乙型肝炎是由感染乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙類傳染病。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，一般人群HBV感染率高達57.6％，HBV攜帶率高達9.09％，HBsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）陰性的隱匿性HBV感染在我國普遍存在。HBV感染可引起肝硬

3、化和肝癌，嚴重危害機體健康和生命安全。因此在輸血前血液安全篩查中，乙型肝炎抗原及核酸成分的檢測就成為主要靶點。
　　 利用ELISA檢測HBsAg是應用最早，開展最廣的檢測方法，但由于該技術是利用酶催化底物顯色的方法，靈敏度較低，操作誤差大，易出現(xiàn)假反應性或假非反應性，給血液安全檢測帶來不確定性。目前我國地市級血站系統(tǒng)采用由雙人兩次通過ELISA法檢測HBV的方法以減少誤差，但實際上此方法僅僅是增加了檢測的次數(shù)，雖可減少操作者方

4、面的實驗誤差，但不能避免因加樣、洗板、變異系數(shù)較大等引起的方法學上的固有誤差。
　　 近年來，核酸檢測技術(NAT，NucleicAcidTest)在輸血前血液篩查中的應用受到高度關注。NAT是直接檢測病原體核酸的一系列技術的總稱，利用該技術可在病毒感染后數(shù)天后即能檢出標本中極微量的核酸，大大縮短“窗口期”。NAT敏感性高，與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，雖然不能完全消除感染“窗口期”，但由于病毒核酸轉陽之前的血液傳染性極低，通過N

5、AT檢測，能夠明顯減少隱匿性感染和病毒變異株，最大限度地預防經(jīng)輸血傳播病毒性疾病，因此，NAT可使經(jīng)輸血傳播疾病的危險性降到最低，有望成為一種新型的血液篩查傳染病的檢測技術。
　　 隱匿性HBV感染(OBI)即血清HBsAg陰性而HBV-DNA陽性的HBV感染，表現(xiàn)為病毒載量持續(xù)處于低水平復制狀態(tài)。OBI血液可以通過輸血導致受血者感染HBV，其感染率與各地區(qū)的HBV感染率和基因型相關。HBsAg陰性的隱匿性HBV感染在我國普遍存

6、在，約有3％的正常人或獻血員為HBsAg陰性的HBV攜帶率者，在單一抗HBc陽性人群中有30％-35％血清HBVDNA陽性，是形成隱匿性乙肝病毒感染的基礎。
　　 多種原因可能造成隱匿性HBV感染，位于aa124～147的“a”表位是HBsAg的免疫優(yōu)勢表位，是當前HBsAg檢測的主要靶點，HBsAg表位基因突變是導致HBsAg漏檢是最主要原因之一。有報道aa100～160氨基酸突變可引起HBsAg抗原活性的明顯改變。由于“a”

7、表位也是乙肝疫苗的主要保護性表位以及抗乙肝免疫球蛋白的主要靶點，“a”表位突變可使現(xiàn)有乙肝疫苗及診斷試劑的靈敏度下降，因此研究HBsAg“a”表位對應的HBVS區(qū)基因序列具有特別重要的理論和實際意義。
　　 本課題以省級血液中心為研究基地，選擇93613份無償獻血標本，采用NAT、基因突變檢測和化學發(fā)光免疫技術對血液中乙型肝炎病毒的核酸和抗原、抗體聯(lián)合檢測，并與傳統(tǒng)的ELISA對比研究;對HBsAg酶聯(lián)免疫法檢測陰性但NAT檢測

8、DNA陽性的血清標本進行DNA序列分析和抗體蛋白的確認與分型，探討HBsAg陰性血清模式與HBVDNA的關系，尋找窗口期和隱匿性HBV感染者;對隱匿性HBV感染者病毒株基因變異進行分析，對病毒株的“a”表位區(qū)域進行基因序列測定，分析“a”表位基因突變情況。
　　 本論文旨在了解目前我國HBV篩查體系下獻血者隱匿性HBV感染及HBsAg突變株流行狀況，建立更為靈敏、準確、符合國際標準要求的輸血前血液篩查新模式，并根據(jù)篩查結果計算輸

9、血傳播傳染性疾病的殘余風險。此外，本文還初步探討了肝癌細胞PI3K/PKB信號轉導通路對細胞凋亡抑制蛋白Survivin變化的影響，旨在為HBV密切相關的肝癌診斷及治療提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分：輸血前應用NAT大規(guī)模篩查乙肝病毒的模式構建及應用研究
　　 研究方法:
　　 1.核酸檢測實驗室體系的構建:按照衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴增實驗室管理暫行辦法》，建立標準核酸檢驗實驗室，之后所有NAT檢測均在此實驗室

10、進行。
　　 2.不同采血點血液標本的匯集和處理:將不同采血點冷鏈運送來的標本信息錄入采供血及臨床輸血管理網(wǎng)絡體系平臺。樣品處理:采用血清或抗凝血漿，離心后，取上清用于核酸檢測。收集的樣品置4℃保存，24小時內(nèi)進行檢測。
　　 3.建立健全樣品采集-預處理-保存-使用的標準化流程。標本離心后，經(jīng)全自動加樣儀自動讀取標本條碼并加樣，生成加樣文件，發(fā)送至實驗室服務器的相應加樣數(shù)據(jù)目錄下，由全自動酶免分析儀和核酸檢測儀處理，將

11、其檢測結果相關數(shù)據(jù)發(fā)送至實驗室服務器的相應檢測數(shù)據(jù)目錄下，實驗室信息管理系統(tǒng)(LIS)將對應的加樣數(shù)據(jù)與檢測結果相關數(shù)據(jù)進行處理后，生成每個標本相應檢測項目的檢測結果釋放至血站信息管理系統(tǒng)(Blood Station Information Management System，BIS)。通過深孔板的同步留樣，避免人工誤差和傳統(tǒng)辮血留樣錯誤，配以信息化的管理方式取代人工保存，保證血樣檢測結果的還原性。
　　 4.ELISA法檢測相

12、應的抗原或抗體:ELISA法采用雙抗原夾心法或雙抗體夾心法檢測相應的抗體或抗原。最后在450/630nm處測讀吸光度值。按照試劑說明書設立臨界值。檢測孔A值大于臨界值則為反應性，否則為非反應性。酶聯(lián)免疫法的操作嚴格按照使用說明書進行，其中核心抗體檢測時用生理鹽水作1∶30稀釋。
　　 5.標準NAT檢測自動化流程建立:初期采用半自動化設備進行測試，探索出試劑準備、樣品核酸提取到檢測的適宜條件，最后形成樣品自動匯集、檢測的標準自動

13、化流程。配套條碼掃描，測試過程可全程監(jiān)控。
　　 6.核酸測定:采用合并檢測方式進行。選擇ALT陰性，ELISA測定HBsAg陰性、抗HCVAb陰性、抗HIVAb陰性的樣品以及僅1種ELISA試劑為陰性的標本進行HBV、HCV和HIV病原體核酸的檢測。初篩檢測方式為合并檢測(6個樣本混合）。當合并檢測匯集池樣品中HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA任何1項為反應性時，對該匯集池樣品再進行拆分檢測，挑選出對應的單份反應性樣品。

14、合并檢測方式同時需滿足單份樣品臨床檢測的敏感性要求。
　　 7.NAT體系的方法學評價:采用衛(wèi)生部臨檢中心及國際血篩標準品對檢測結果的有效性進行評估。當發(fā)現(xiàn)檢測結果出現(xiàn)偏差時，立即停止試驗，查明原因后再繼續(xù)進行，確保實驗結果準確有效。使用該體系對本中心近30000份樣本進行連續(xù)檢測，有效評估實驗整體的性能及穩(wěn)定性。
　　 8.復檢及確認:所有ELISA非反應性，NAT反應性標本都將備份管寄送至中國衛(wèi)生部臨檢中心作HBVD

15、NA、HCVRNA和HIVRNA分項定量檢測。并對獻血者進行隨訪，以觀察是否為抗體檢測窗口期標本。
　　 9.統(tǒng)計學處理
　　 數(shù)據(jù)處理分析采用SPSS10.0軟件進行方差分析，Student't檢驗來判斷差異的統(tǒng)計學意義，P＜0.05具有顯著性意義。
　　 研究結果：
　　 1.NAT檢測模式和流程的設計:構建了NAT大規(guī)模篩查乙肝病毒的檢測模式和流程。
　　 2.NAT檢測的數(shù)據(jù)統(tǒng)計:9361

16、3份無償獻血的標本中，經(jīng)ELISA篩查HBsAg、抗HCV和抗HIV-1/2非反應性及僅1種ELISA試劑為非反應性的標本共91271份，經(jīng)NAT檢測其中有60例反應性標本，反應性檢出率為0.066％。
　　 3.NAT反應性標本定量檢測:NAT分項鑒別實驗反應性率為63.33％(38/60)。在我國經(jīng)血傳播疾病病毒酶免試劑陰性核酸試劑陽性獻血者標本中，以HBV為主，不同于國外HIV為主的流行模式。
　　 4.HBVDN

17、A反應性標本病毒含量分布:38例HBVDNA反應性標本中病毒含量＜20IU/ml的標本28例，占73.68％;20～100IU/ml的標本4例，占10.53％。
　　 5.HBV檢測單試劑反應分析:HBV38例單試劑反應性樣本中，使用中國產(chǎn)試劑16例，使用美國雅培公司試劑22例;經(jīng)NAT確認反應性2例，為美國雅培公司試劑單試劑檢出。
　　 6.血液篩查核酸檢測系統(tǒng)指標:血液篩查核酸檢測系統(tǒng)的單項檢測靈敏度≥95％，單項檢

18、測特異性≥95％，單項檢測檢測下限是50IU/ml，單項檢測下限檢出率≥95％。檢測通量≥300例樣本/每日。
　　 第二部分：HBsAgELISA-/NAT+的HBV血清學模式和病毒變異分析
　　 研究方法：
　　 1.HBVDNA提取:使用QIAampMinElute病毒核酸提取試劑盒提取血清標本中病毒DNA。
　　 2.PCR擴增:PCR擴增使用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶在BIO-RADI

19、C-Cycler梯度PCR擴增儀或PE2400PCR擴增儀上進行目的片段PCR擴增。引物HBSSWF:AACATCAGGATTCCTAGGAC;HBSSWR:CCTTGTAAGTTGGCGAGAA;HBSS-F:TTCATCCTGCTGCTATGCC;HBSS-R:ACGTTTGGTTTTATTAGGGTTC，擴增產(chǎn)物理論上包含HBVpre-S和S區(qū)基因。50μlPCR反應體系中加入5×PrimeSTARTMBuffer(Mg2+plu

20、s)10μl,dNTPMixture(各2.5mM)4μl,Primer1(10uM)1μl,Primer2(10uM)1μl，上述提取的模板DNA2～4μl，PrimeSTARTMHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl，滅菌蒸餾水加至50μl。PCR反應條件為95℃預變性2min。94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸55s，共40個循環(huán)。72℃2min。反應體系:10×buffer1.0μl,primer

21、F1.0μl,R1.0μl,dNTP1.0μl,Taq0.4μl，ddH2O3.6μl，cDNA2.0μl。每輪PCR均設陰陽性對照，以不同拷貝數(shù)的HBV標準質粒為陽性對照，敏感度為50copy/ml。PCR產(chǎn)物取2μl用2％瓊脂糖凝膠電泳觀察。
　　 3.PCR產(chǎn)物純化:使用TBE緩沖液制作1.5％瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，載樣液中加入SYBRGreenⅠ。對于擴增產(chǎn)物量大（電泳條亮帶）的標本擴增50μl

22、體系后電泳，對于擴增產(chǎn)物量小的標本擴增100μl體系后電泳，使用膠純化試劑盒純化擴增產(chǎn)物。
　　 4.DNA測序:PCR產(chǎn)物克隆，質粒抽提，使用BigDye測序反應試劑盒在ABIPRISM3730型全自動DNA測序儀上進行雙向測序。
　　 5.HBV基因分型和序列分析:對擴增陽性的PCR產(chǎn)物進行序列測定和進化分析，確定所攜HBV的基因型。
　　 6.生物信息學軟件處理:測序結果采用ContigExpress、ME

23、GA4生物信息學軟件進行分析處理。測得基因片段序列與各基因型參比序列用Blast進行同源列隊，比較分析基因突變情況。
　　 研究結果：
　　 1.HBVpre-S/S基因PCR擴增結果:56例標本中有41例標本PCR擴增不佳，僅有15例標本PCR產(chǎn)物電泳均可看到1400bp的特異性條帶。大部分標本擴增產(chǎn)物量較小，特異性條帶較弱。
　　 2.無償獻血者中隱匿性HBV感染情況及基因型分析:23例ELISAHBsAg陽

24、性標本和15例隱匿性HBV標本經(jīng)巢式PCR擴增陽性檢測基因型，結果顯示，C基因型在隱匿性HBV中的比例(80.0％)明顯高于在HBsAg陽性標本中的比例(17.4％)，p＜0.05。
　　 3.隱匿性HBV感染者表面抗原S區(qū)基因突變分析:3株基因B型和12株基因C型的S區(qū)序列分析。有6例在該區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)了基因序列點突變，其中有3例為1個堿基點突變，3例發(fā)生2個位點的堿基點突變。12例HBV基因C型感染者有4例出現(xiàn)基因點突變，而另3

25、例HBV基因B型感染者中，2例出現(xiàn)基因突變株。
　　 4.HBVS基因“a”決定簇內(nèi)點突變分析:15例HBsAgELISA-NAT+標本測序結果表明“a”決定簇內(nèi)點突變較多，有6例標本存在9個位點處的“a”決定簇內(nèi)堿基點突變，主要以A-C突變多見。
　　 第三部分：ELISA-/NAT+獻血者血液HBV抗原抗體確認的研究
　　 研究方法：
　　 1.HBsAgELISA-/NAT+獻血者隨訪策略和隨訪流程

26、的設計和建立
　　 2.標本采集及處理
　　 3.ECLIA法檢測HBV抗體和抗原
　　 4.NAT檢測
　　 5.統(tǒng)計學處理
　　 研究結果：
　　 1.HBsAgELISA-/NAT+獻血者隨訪策略和隨訪流程的設計和建立。
　　 2.ELISA（-）NAT(+)獻血者隨訪:對60名ELISA（-），NAT(+)獻血者立即進行隨訪，追蹤成功26人(34人次)。乙型肝炎病毒表面抗原

27、轉陽的有3人;HBV核酸轉陰的5人;乙型肝炎病毒表面抗原未轉陽但核酸仍為反應性的10人。
　　 3.無償獻血者中HBV窗口期標本追蹤檢測概況
　　 4.HBsAgELISA-/NAT+獻血者HBV抗體確認。對將59人份核酸檢測陽性血液標本進行乙肝“兩對半”檢測，結果顯示，其中有1人HBsAg陽性，HBcAb陽性43人、HBsAb陽性26人，HBcAb單陽性13人。
　　 5.抗-HBc的表達與乙型肝炎隱匿性感染的

28、關聯(lián)研究:抗-HBc與HBV隱匿性感染有一定的相關性，抗-HBc不僅可以作為既往HBV感染的標志，也可以提示隱匿性HBV感染的可能。
　　 第四部分：肝癌細胞survivin表達及bFGF的調(diào)控作用
　　 研究方法：
　　 1.細胞培養(yǎng):培養(yǎng)肝癌細胞系(Bel-7402)，培養(yǎng)基為含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每2-3天傳代一次。根據(jù)文獻及預實驗結果對將培養(yǎng)的Bel-7402細胞進行不同濃度，不同時間的bF

29、GF或wortmannin處理。
　　 2.細胞處理:將對數(shù)生長期細胞1×105/ml，接種于培養(yǎng)瓶，待達到70％融合時換成無血清DMEM培養(yǎng)液孵育過夜，使細胞同步化，然后按時間點和濃度點分組施加因素。
　　 3.Westernblot分析:將樣品加適量樣品懸浮緩沖液后，超聲破碎，離心取上清，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。用10％SDS-PAGE電泳后，將PAGE凝膠中的蛋白轉移至硝酸纖維素膜。加入一抗(PKBSer473)

30、進行WesternBlot。最后定影、顯影，分析結果。
　　 4.RT-PCR檢測Bel-7402細胞中survivin的表達。
　　 提取細胞總RNA，設計survivin特異性引物，RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結果并拍照。
　　 5.細胞周期分析:收集消化的貼壁Bel-7402細胞，加入70％冷乙醇固定48h，PI染色，用流式細胞儀進行測定熒光強度。CellQuest分析軟件進行細胞

31、周期DNA含量分析。
　　 6.統(tǒng)計學處理
　　 研究結果：
　　 1.經(jīng)bFGF處理后肝癌細胞PKB活性變化
　　 2.經(jīng)bFGF處理后肝癌細胞survivinmRNA表達的變化
　　 3.PI3K抑制劑對bFGF誘導肝癌細胞survivinmRNA表達的影響。
　　 4.Wortmannin對肝癌細胞凋亡和增殖的影響
　　 研究結論:
　　 1.在輸血前乙型肝炎病毒的血

32、液篩查中，采用ELISA技術對血液標本進行初檢，NAT技術進行復檢的模式，能夠對標本進行精確的定性檢測，對窗口期的標本和隱匿性肝炎標本具有更強的檢出率。
　　 2.目前常規(guī)血液篩查中檢測HBsAg為陰性的合格血液，仍然存在著窗口期漏檢和隱匿性乙肝感染，以隱匿性乙肝為主，病毒株多為C型，且存在著變異株，B型病毒株較少，但突變株較高，突變株可逃避現(xiàn)有的診斷試劑的篩查。
　　 3.抗-HBc與HBV隱匿性感染有一定的相關性，抗

33、-HBc不僅可以作為既往HBV感染的標志，也可以提示隱匿性HBV感染的可能。在不具備開展核酸檢測的地區(qū)，可以開展抗-HBc檢測，以降低輸血風險。
　　 4.bFGF通過依賴PI3K/PKB途徑調(diào)節(jié)肝癌細胞Survivin的轉錄活性，促進其表達，進而抑制肝癌細胞凋亡，PI3K/PKB抑制劑wortmannin可抑制該作用，并導致survivin表達的下調(diào)。
　　 創(chuàng)新點：
　　 1、以省級血液中心為基礎，選擇936

34、13例大樣本，對現(xiàn)有血液篩查模式下ELISA及NAT對HBV血液篩查的應用價值和輸血殘余風險進行對比研究。
　　 2、成功構建以核酸檢測技術組合酶聯(lián)免疫篩查技術的輸血前經(jīng)血傳播病毒性疾病的檢測模式來取代目前單一免疫學檢測模式，顯著降低經(jīng)血傳播疾病的風險。
　　 3、首次研究了本地區(qū)HBV感染者HBV基因類型的分布和變異株的基因序列，豐富了國內(nèi)HBV基因型分布的數(shù)據(jù)，為乙肝疫苗研制和乙肝診斷試劑的改進提供實驗基礎和理論依據(jù)