褐飛虱寄主定位的嗅覺感受機(jī)制.pdf

1、對于植食性昆蟲而言，通過靈敏的嗅覺系統(tǒng)搜尋并定位寄主植物至關(guān)重要。如果能夠明確昆蟲的嗅覺機(jī)制，將為開發(fā)新型有效的害蟲生物防治和監(jiān)控技術(shù)提供新思路。褐飛虱Nilaparvata lugens(St(a)l)是水稻上重要的害蟲，其暴發(fā)性和毀滅性對我國的糧食產(chǎn)量具有嚴(yán)重威脅，以往以化學(xué)藥劑為主的防治措施，已經(jīng)引起了一系列的問題，如褐飛虱抗藥性的增加，環(huán)境的嚴(yán)重污染等。如果能夠明確褐飛虱在寄主定位中的嗅覺感受機(jī)制，可以為應(yīng)用昆蟲的嗅覺行為調(diào)控褐

2、飛虱為害提供理論依據(jù)。為此，本課題以水稻害蟲褐飛虱為研究對象，在實驗室前期的工作基礎(chǔ)上，對褐飛虱寄主定位的信息化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，克隆與嗅覺相關(guān)的氣味結(jié)合蛋白基因(OBPs)NlugOBPs基因并進(jìn)行原核表達(dá)純化，分析了與NlugOBP4有良好結(jié)合特性的氣味物質(zhì)對褐飛虱的行為活性，以期為明確褐飛虱的嗅覺感受機(jī)制及研發(fā)其行為調(diào)控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下:
　　1褐飛虱寄主定位信息化學(xué)物質(zhì)的分離鑒定
　　利

3、用GC-EAD和GC-MS技術(shù)，對褐飛虱觸角具有活性的水稻揮發(fā)物進(jìn)行了分離鑒定。結(jié)果表明，褐飛虱成蟲觸角對水稻揮發(fā)物有電生理反應(yīng)的有5種物質(zhì):其中反應(yīng)顯著且實驗重復(fù)性最高的有2種，分別為1，6-Octadien-3-ol，3，7-dimethyl-（芳樟醇）和Undecane，2，6-dimethyl-（2，6-二甲基-十一烷），重復(fù)性達(dá)到13次以上;其次為Benzene，1，4-dichloro-（1，4-二氯苯）、cis-Linal

4、oloxide（順式氧化芳樟醇）和Tridecane（正十三烷）等3種化合物，重復(fù)性也有10-13次，推測這幾種物質(zhì)對褐飛虱可能有引誘或者趨避作用。
　　2褐飛虱NlugOBPs基因的克隆及分析
　　依據(jù)已經(jīng)建立的褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了褐飛虱NlugOBP8、NlugOBP9、NlugOBP10(GenBank登錄號依次為KC663687、KC663688和KC663689)的3個基因。分析結(jié)果表明，3個褐飛虱OBPs都具

5、有完整的開放閱讀框，全長分別為414bp、576bp、756bp，分別編碼137、191、251個氨基酸，蛋白分子量分別為15.09kDa、20.98kDa、27.88kDa，等電點分別為4.38、6.06、7.97;經(jīng)過多重序列比對分析序列的保守特征表明，NlugOBP8基因具有6個保守的Cys位點，與經(jīng)典OBPs的特征相符合，屬于Classic OBPs，而NlugOBP9和NlugOBP10都具有8個保守的Cys位點和1個Pro位

6、點，屬于Plus-C OBPs;預(yù)測3個NlugOBPs序列的N-末端信號肽表明，僅NlugOBP8含有21個氨基酸組成的信號肽序列，NlugOBP9和NlugOBP10均無信號肽。
　　3褐飛虱NlugOBPs原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-NlugOBPs，pET-17b-NlugOB Ps，pET-20b(+)-NlugOBPs, pET-22b(+)-NlugOBPs, pET-30

7、a(+)-NlugOBPs以及pET-32a(+)-NlugOBPs的重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21(DE3)/BL21(DE3)PlysS中進(jìn)行試表達(dá)，僅有pGEX-6P-1-NlugOBP8/NlugOBP10和pET-32a(+)-NLugOBP8/NLugOBP10試表達(dá)成功。
　　4褐飛虱行為選擇試驗
　　基于實驗室已完成的褐飛虱NlugOBP4蛋白的熒光競爭結(jié)合實驗結(jié)果，利用H型嗅覺儀，對結(jié)合活性高的

8、22種水稻揮發(fā)物單體和GC-EAD篩選出的2種活性物質(zhì)單體（其中芳樟醇是重復(fù)存在的）進(jìn)行了行為測定。結(jié)果表明，香葉烯和2-庚酮在稀釋50倍的濃度下均對褐飛虱成蟲具有引誘作用，但2-庚酮在稀釋10倍和100倍濃度時卻又對褐飛虱成蟲驅(qū)避反應(yīng)顯著;不同濃度下均對褐飛虱成蟲有明顯驅(qū)避反應(yīng)的有芳樟醇和辛烯，而(+)-檸檬烯、蒈烯、反式石竹烯、側(cè)柏烯、二十一烷、正十三烷、庚醇、反-2-己烯醇、苯甲醛、己醛、β-紫羅蘭酮以及苯甲酸甲酯等物質(zhì)僅在一定濃