褐飛虱瞬時感受器電位(TRP)通道家族基因分析及功能研究.pdf

1、TRP通道家族基因廣泛分布于脊椎和無脊椎動物體內(nèi)，幾乎參與了所有感覺的形成，例如觸覺、嗅覺、聽覺、本體感覺等。最新研究表明，昆蟲TRP通道家族的TRPV亞家族中，Nanchung和Inactive蛋白所形成的復(fù)合物是殺蟲劑吡蚜酮的分子靶標(biāo)(Nesterov et al.，2015)，這是首次報道TRP通道家族基因可作為殺蟲劑分子靶標(biāo)。但是目前對于昆蟲該家族基因的研究僅局限于果蠅等模式生物中，在農(nóng)業(yè)害蟲中的研究較少。
　　本文以農(nóng)業(yè)

2、害蟲褐飛虱為研究對象，克隆得到了褐飛虱全部共13個TRP通道家族基因，利用定量PCR技術(shù)探明了各基因在褐飛虱不同齡期和成蟲各組織中的表達(dá)分布，并利用RNAi技術(shù)研究了各基因沉默后對褐飛虱生存率、運(yùn)動協(xié)調(diào)及對觸覺響應(yīng)等的影響。
　　一、褐飛虱TRP通道家族基因克隆及序列分析
　　通過將果蠅TRP通道家族的蛋白序列與褐飛虱基因組以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行TBLASTN比對后，我們鑒定得到了編碼褐飛虱TRP通道的基因片段，通過進(jìn)一步的PC

3、R和RACE實(shí)驗(yàn)，我們克隆得到了13個褐飛虱TRP通道家族基因。根據(jù)果蠅中TRP通道的分類方法，將鑒定克隆得到的13個褐飛虱TRP通道基因劃分為TRPC、TRPA、TRPV、TRPN、TRPM、TRPML6個亞家族。褐飛虱TRPA亞家族的進(jìn)化過程與果蠅等有差異，并不存在果蠅DmPyx基因的同源基因，反而具有兩個TRPA5基因，NlTRPA5-1和NlTRPA5-2，其它亞家族的基因在進(jìn)化過程中相對保守。同時，我們發(fā)現(xiàn)TRPC、TRPV、

4、TRPN、TRPM、TRPML這五個亞家族的基因在不同物種的進(jìn)化過程中較為保守，其中褐飛虱TRPC亞家族的三個基因之間也具有較高的同源性，而TRPA亞家族除NlTRPA1和NlWtrw外，其他基因則在進(jìn)化過程中并不保守。褐飛虱TRP通道家族的基因除NlPain和NlWtrw外，其它的11個基因均具有較多的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)，其中NlTRPM的CDS區(qū)具有數(shù)目最多的外顯子。褐飛虱TRP通道家族均具有六個跨膜結(jié)構(gòu)域和位于第五和第六跨膜結(jié)構(gòu)域

5、間的孔道結(jié)構(gòu)，并且在TRPC、TRPN、TRPM亞家族的所有基因中的C末端均具有TRP結(jié)構(gòu)域(EWKFAR和LPPPFN)。不同基因間在N端的錨蛋白重復(fù)序列數(shù)目不同，NlTRPL、NlWtrw、NlTRPA5-1、NlIav、NlTRPM的C末端還存在卷曲螺旋區(qū)域(coiled coil region)。
　　二、褐飛虱TRP通道家族基因的表達(dá)模式
　　通過熒光定量PCR的方法，對在褐飛虱體內(nèi)克隆得到的13個TRP通道家族的

6、基因進(jìn)行了表達(dá)模式的研究。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，褐飛虱NlTRP與NlTRPL高表達(dá)于褐飛虱的頭部，這與這兩個基因的視覺傳導(dǎo)功能相吻合。NlTRPγ在觸角和頭部的表達(dá)水平最高，而且雄性高于雌性。TRPA亞家族中各成員在成蟲期的表達(dá)水平均最高，而卵期則相對表達(dá)較低;MlTRPA1高表達(dá)于觸角，其他基因在所有組織中均能檢測到，但是具體的表達(dá)模式則各不相同。TRPV亞家族的NlNan與NlIav在成蟲期雄蟲表達(dá)量高于雌蟲并且主要表達(dá)于觸角，NlNa

7、n在成蟲中表達(dá)量最高，NlIav則主要表達(dá)于1齡若蟲時期。TRPN亞家族的NlNompC主要表達(dá)于腹部，成蟲期表達(dá)量高于其它齡期。NlTRPM在腹部及胸部具有較高的表達(dá)，在各個齡期均可檢測到。NlTRPML在短翅型褐飛虱中的表達(dá)水平最高，主要表達(dá)于褐飛虱的腹部。
　　三、褐飛虱TRP通道基因沉默對其存活率的影響
　　我們分別合成了褐飛虱TRP通道家族13個基因的dsRNA，分別對褐飛虱3齡若蟲進(jìn)行注射，經(jīng)過熒光定量PCR對沉