超聲聲孔效應(yīng)增敏兔VX2腫瘤化療效果的實驗研究.pdf

1、背景:
　　 空化效應(yīng)是指液體中微泡在超聲波作用下發(fā)生振蕩、膨脹、收縮、內(nèi)爆等變化，產(chǎn)生瞬態(tài)高溫、高壓、沖擊波及噴射流等多種能量釋放行為。有研究表明，超聲擊破微泡產(chǎn)生的物理流能使離體腫瘤細胞膜表面產(chǎn)生孔隙，增大細胞膜通透性，從而提高細胞藥物攝取量，增強藥物的細胞毒性作用，促使細胞死亡。該發(fā)現(xiàn)引起超聲界普遍關(guān)注，并嘗試將其用于治療惡性腫瘤。惡性腫瘤的治療一直是臨床工作的重點和難點，化療是其主要治療手段之一，但多藥耐藥(Muti-d

2、rugresistance，MDR)的情況頻繁發(fā)生，使得化療的總體成功率不高，成為治療腫瘤的最大障礙。多藥耐藥是指腫瘤細胞接觸了某種抗癌藥物后產(chǎn)生了對其他多種未接觸過的、結(jié)構(gòu)和作用機理完全不同的抗癌藥物的耐藥性。有研究表明，多因素致腫瘤細胞對抗癌藥物攝取減少是MDR主要的生物化學(xué)機制之一。國內(nèi)外學(xué)者嘗試通過超聲增強離體腫瘤細胞化療效果并取得初步成果，展示出誘人前景。但在體腫瘤細胞不同于離體腫瘤細胞，前者與微泡之間有微血管及組織間隙隔離;

3、而后者微泡可緊貼離體細胞，微泡被超聲擊破產(chǎn)生的物理流與離體細胞距離近，作用力大。雖有研究報導(dǎo)，單純超聲也可使離體腫瘤細胞膜表面產(chǎn)生裂隙，增加化療藥的細胞毒性，但單純超聲作用于活體時由于生物體內(nèi)缺乏自身空化核，通常需要較高聲壓激勵才能產(chǎn)生殺傷作用，可出現(xiàn)損傷周圍正常組織等副作用，可控性差。載藥微泡是將治療性藥物粘附、結(jié)合或鑲嵌在微泡被膜層甚至整合在微泡內(nèi)部，在血液中可減少與其他藥物作用或體內(nèi)酶反應(yīng)，聯(lián)合超聲輻照可實現(xiàn)靶向藥物釋放，增加靶區(qū)

4、藥物濃度，達到治療病灶的目的。但由于微泡殼上載藥的“空穴”受限，載藥量少。若增加微泡壁的厚度可提高載藥量，又會加大微泡制作工藝的難度。有學(xué)者在小鼠后肢皮下建立肝癌模型，觀察到靶向超聲微泡爆破組的腫瘤伊文思藍滲出量明顯高于單純超聲輻照組，證實靶向超聲微泡爆破能增加肝癌毛細血管的瞬間通透性，加大化療藥物在組織間隙的彌散，達到治療腫瘤的目的。但微泡能否穿越血管壁上的孔隙進入組織間隙并產(chǎn)生二次甚至多次空化還是個未知的問題，并且超聲聲孔效應(yīng)能否在

5、活體腫瘤細胞膜上“打孔”，增加細胞膜甚至核膜通透性，增強腫瘤化療效果的研究也未見報道。
　　 目的:
　　 本研究利用硝酸鑭示蹤電鏡觀察活體VX2腫瘤細胞膜通透性改變，了解超聲治療儀不同聲強、脈沖寬度、輻照時間和不同微泡劑量下聲孔效應(yīng)致腫瘤細胞膜及核膜等超微結(jié)構(gòu)改變，能否在細胞膜甚至核膜上產(chǎn)生孔隙，并摸索出增大腫瘤細胞膜通透性的適宜聲學(xué)參數(shù);在此基礎(chǔ)上，進一步探討超聲聯(lián)合微泡致聲孔效應(yīng)對VX2腫瘤化療效果的影響。

6、　　 材料和方法:
　　 1.主要實驗材料
　　 實驗儀器:CZ-906A型超聲治療儀，探頭直徑2.5cm，面積4.9cm2，聲強在0.21W/cm2～1.09W/cm2可調(diào)，脈沖寬度在1.21ms～6.05ms可調(diào)。PhilipsIU22彩色多普勒超聲儀，L9-3高頻線陣探頭，配有超聲造影模式。HitachiH-600型透射電子顯微鏡。
　　 超聲微泡:南方醫(yī)院藥學(xué)基地研制的“全氟顯”，為凍干人血白蛋白包裹全

7、氟丙烷氣體，每支用前加入3ml生理鹽水，然后緩慢搖勻制成混懸液備用。所產(chǎn)生的微泡平均直徑2.9μm，其中98％＜7μm，微泡濃度1～2×109個/ml。
　　 其他試劑:速眠新Ⅱ注射液，阿托品，3％戊巴比妥鈉，阿霉素，生理鹽水。
　　 實驗動物:健康新西蘭白兔73只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5kg，由南方醫(yī)院實驗動物研究中心提供。VX2腫瘤組織勻漿由廣州中山大學(xué)實驗動物中心提供。
　　 2.動物模型制備

8、>　　 2.1超聲致微泡聲孔效應(yīng)增強兔VX2腫瘤細胞通透性的適宜聲學(xué)參數(shù)的研究:以0.35ml/kg速眠新Ⅱ注射液及0.25ml/kg阿托品注射液將后肢外側(cè)肌層內(nèi)荷VX2腫瘤的新西蘭白兔肌肉注射麻醉，并建立耳緣靜脈通道以注射適量3％戊巴比妥鈉，側(cè)臥位固定于實驗臺上，荷瘤部位及其周圍1.5cm處脫毛，充分暴露，碘伏及酒精先后分別消毒兩次，無菌條件下取出腫瘤，并迅速剔除周邊結(jié)締組織及中央壞死區(qū)，將保留的新鮮魚肉樣組織置于無菌生理鹽水中，眼

9、科剪將其剪成1mm3的小塊，分別接種于45只健康新西蘭白兔雙側(cè)后肢外側(cè)肌層內(nèi)，約14天后用于實驗。
　　 2.2超聲微泡聲孔效應(yīng)增強兔VX2腫瘤化療效果的實驗研究:前與(1)相同，用眼科剪剪成1mm3的小塊后分別接種28只健康新西蘭白兔右后肢外側(cè)肌層內(nèi)，約11d后用于實驗。
　　 3.實驗流程
　　 3.1超聲致微泡聲孔效應(yīng)增強兔VX2腫瘤細胞通透性的適宜聲學(xué)參數(shù)的研究:以聲強、脈沖寬度、輻照時間、微泡劑量為處理

10、因素將符合實驗條件的38只肌層內(nèi)荷VX2腫瘤新西蘭白兔分成四組，依次考察各處理因素?？疾炷骋灰蛩馗魉介g差別時其他因素的水平固定不變。每一水平重復(fù)實驗5次。嚴(yán)格設(shè)置各處理因素不同水平的條件，輻照時超聲探頭置于腫瘤體表處，同時經(jīng)靜脈通道連續(xù)、緩慢注入微泡。治療結(jié)束后立即用鋒利刀片切開腫瘤最突出體表處并切取腫瘤邊緣魚肉樣組織，制作組織切片，利用硝酸鑭示蹤透射電鏡觀察腫瘤細胞通透性的變化，并對各處理因素的每個水平隨機選取3個腫瘤組織用以HE染

11、色病理檢查。前一處理因素的最佳參數(shù)水平確定后即可考察后一處理因素，依次得出四個因素的適宜聲學(xué)參數(shù)。
　　 3.2超聲微泡聲孔效應(yīng)增強兔VX2腫瘤化療效果的實驗研究:將符合實驗條件的24只右后肢肌層內(nèi)荷VX2腫瘤新西蘭白兔隨機分為阿霉素組、阿霉素+微泡組、阿霉素+超聲組、阿霉素+微泡+超聲組。阿霉素+微泡+超聲組經(jīng)靜脈注射化療藥，2min后運用脈沖式超聲治療儀在腫瘤部位輻照，同時經(jīng)靜脈連續(xù)、緩慢注入微泡。阿霉素+超聲組用3ml生理

12、鹽水代替微泡緩慢推注;阿霉素+微泡組超聲治療儀不發(fā)射超聲能量;阿霉素組僅用3ml生理鹽水代替微泡緩慢推注，亦不發(fā)射超聲能量。每次作用10min，隔天治療一次。治療前采集各時間點二維超聲圖像和超聲造影圖像，測量腫瘤切面最大長徑、厚度及寬度，觀察腫瘤體積變化。
　　 4.數(shù)據(jù)分析
　　 腫瘤細胞膜通透性改變以細胞內(nèi)鑭顆粒數(shù)目為觀察指標(biāo)，按鑭顆粒數(shù)目多少分為0-5級，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，同一處理因

13、素水平間鑭顆粒數(shù)目評分比較采用Kruskal-WallisH檢驗，若同一處理因素總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則采用Mann-WhitneyU檢驗對任意兩水平間進行比較。腫瘤化療效果以腫瘤體積為觀察指標(biāo)，腫瘤體積大小用(x)±s表示，治療前、后各時間點、各組腫瘤體積大小比較采用單向方差分析(One-WayANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.超聲致微泡聲孔效應(yīng)增強兔VX2腫瘤細胞通透性的適宜聲

14、學(xué)參數(shù)的研究:聲強為0即超聲不發(fā)射能量時腫瘤細胞漿內(nèi)未見鑭顆粒。聲強為0.21W/cm2、0.43W/cm2、0.65W/cm2時均觀察到腫瘤細胞漿內(nèi)鑭顆粒存在。聲強是0.43W/cm2時細胞漿內(nèi)鑭顆粒數(shù)目評分較其他水平高(P＜0.01)。脈沖寬度為2.42ms時腫瘤細胞漿內(nèi)鑭顆粒數(shù)目評分較其他水平高（2級，P＜0.05）。輻照時間為10min時腫瘤細胞漿內(nèi)鑭顆粒數(shù)目評分與其他水平比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤細胞漿內(nèi)鑭

15、顆粒沉積隨微泡劑量增加而有上升趨勢，劑量在0.50ml/kg時評分最高（2-3級，P＜0.05）。各處理水平下細胞核內(nèi)均未見鑭顆粒存在。
　　 2.超聲微泡聲孔效應(yīng)增強兔VX2腫瘤化療效果的實驗研究:兔VX2腫瘤在13天的實驗周期內(nèi)，阿霉素+微泡+超聲組、阿霉素+微泡組、阿霉素+超聲組、阿霉素組的腫瘤平均體積，從0.42±0.36cm3、0.70±0.62cm3、0.55+0.30cm3、0.53+0.42cm3生長至0.48±

16、0.44cm3、1.61±1.06cm3、1.89±0.81cm3、1.62+0.69cm3，阿霉素+微泡+超聲組腫瘤體積明顯小于其它三組(P＜0.05)。阿霉素+微泡組、阿霉素+超聲組、阿霉素組腫瘤體積大小差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。阿霉素+微泡+超聲組的腫瘤生長率最小，明顯低于其他三組。阿霉素+微泡+超聲組、阿霉素+微泡組、阿霉素+超聲組的腫瘤生長抑制率相對于阿霉素組依次為70.4％、0.6％、-16.7％。
　　

17、 結(jié)論:
　　 1.超聲致微泡聲孔效應(yīng)不僅能在微血管內(nèi)膜上產(chǎn)生孔隙，微泡還能穿過增大的孔隙到達腫瘤細胞周圍的組織間隙發(fā)生空化效應(yīng);或者微血管內(nèi)的微泡首次被超聲波擊碎后可能變成更小的微氣泡，這些更小的微氣泡受超聲輻射力的驅(qū)動穿越增大的微血管內(nèi)皮孔隙進入腫瘤組織間隙，并產(chǎn)生二次甚至多次聲孔效應(yīng)。
　　 2.超聲致微泡聲孔效應(yīng)引起在體腫瘤細胞膜通透性改變呈現(xiàn)一定規(guī)律性。
　　 3.適宜聲學(xué)參數(shù)下，超聲輻照聯(lián)合微泡致聲孔