經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射碘油化療藥乳劑治療實驗兔移植性VX2腫瘤的療效和機理研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分:經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射CALE治療兔移植性VX2瘤療效研究 目的:觀察經(jīng)皮穿刺局部注射CALE和其組成成分對兔移植性VX2腫瘤的治療效果，評價CALE和其組成成分的作用。 材料與方法: 一、種植瘤模型制作新西蘭大白兔14只，采用瘤細胞混懸液局部注射接種法，于左、右大腿肌肉內(nèi)穿刺接種VX2瘤株。行B超觀察種植瘤生長情況，14～16天后瘤塊直徑達2cm以上瘤灶作為實驗瘤模型。

2、二、治療藥劑的配制及治療方法本研究主要使用三種藥劑： ①單純碘油：超乳化碘油； ②化療藥物溶液：將阿霉素、絲裂霉素及卡鉑三種粉劑溶解于4ml非離子造影劑中； ③CALE：將阿霉素、絲裂霉素及卡鉑加入造影劑和碘化油(兩者體積比1:1)4ml內(nèi)，充分混勻乳化。 三、實驗分組及處理 1.分組及治療滿足治療條件的移植性VX2瘤模型兔14只，按瘤灶內(nèi)注射藥物成份不同隨機分4組。 ①碘油組：4只8個瘤

3、灶，分別行經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)一次性注射超乳化碘油(2ml／瘤)。 ②化療藥物組：4只8個瘤灶，分別行經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)一次性注射化療藥物溶液(2ml／瘤)。 ③CALE組：4只8個瘤灶，分別經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)一次性注射CALE(2ml／瘤)。 ④對照組：2只4個瘤灶，未治療，作為病理對照。 2.術(shù)后觀察處理 ①觀察實驗兔反應(yīng)、活動及進食情況。 ②治療術(shù)后7天處死實驗兔，解剖分離瘤灶，觀察各組瘤體大體標本、壞

4、死情況并計算腫瘤壞死率。 ③瘤灶取材固定：行病理學光鏡(HE染色)、電鏡觀察；以免疫組織化學方法檢測各組增殖細胞核抗原(prolifcratingcellnuclearantigens,PCNA)和血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrothfactor,VEGF)的表達。 四、統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料用mean±SD，多組間比較采用完全隨機設(shè)計的方差分析(onew

5、ayANOVA)；P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: 一、動物模型制作及治療：VX2瘤株雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉內(nèi)接種成功率100％，接種16天，瘤灶大小平均2.3±0.25cm；B超顯示腫瘤血供豐富。在靜脈全麻及B超引導下行瘤塊局部穿刺及注藥，治療成功率100％。 二、術(shù)后觀察 (一)、一般情況各組實驗兔治療術(shù)后反應(yīng)、活動及進食情況與術(shù)前相比均無明顯變化。 (二)、病理觀察 1.大體觀察

6、 ①對照組(未治療)：腫瘤外觀呈灰白色結(jié)節(jié)，類圓形；切面呈灰紅色，鮮嫩呈魚肉樣，有光澤，無壞死。 ②經(jīng)皮瘤內(nèi)注射治療術(shù)后7d，經(jīng)治療之三組均有不同程度的治療改變。 ③壞死率：經(jīng)測量腫瘤壞死徑線，計算各組腫瘤壞死率分別為：碘油組：2.22±0.56％；化療藥物組：7.25±0.82％；CALE組：27.02±3.46％； 2.光鏡及電鏡觀察 (1)HE染色光鏡檢查對照組：VX2瘤組織病理切片見腫瘤呈浸

7、潤性生長，腫瘤細胞排列紊亂，呈巢狀分布，胞核大而濃染，核質(zhì)顆粒粗，部分核呈異形，胞界不清。 (2)透射電鏡觀察對照組：VX2瘤腫瘤細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核增大，核漿比增大，核形狀可見異形，核周濃染，胞漿內(nèi)可見大量擴張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，細胞膜結(jié)構(gòu)完整。 3.瘤組織PCNA及VEGF免疫組織化學法表達PCNA陽性染色為細胞核膜周圍及核內(nèi)被染成黃色或棕黃色，呈顆粒狀或彌漫，PCNA陽性細胞呈彌漫性、片狀或散在分布，PCNA分別為

8、對照組76.50±1.67％。 結(jié)論: 1.制作大腿內(nèi)側(cè)肌肉內(nèi)移植性兔VX2模型簡單，成功率高，血供較豐富，類似人類結(jié)節(jié)型惡性實體癌瘤，位置表淺便于觀察及治療等實驗研究。B超是一種簡便、有效的檢測查監(jiān)測手段。 2.采用經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射局部消融的方法，單純碘油和化療藥物對腫瘤均有一定的治療作用；CALE提高了藥物在局部存留的時間和濃度，增強了局部消融強度，可引起明顯的腫瘤組織壞死，治療效果最明顯。 第二部分

9、：經(jīng)皮瘤內(nèi)注射CALE治療兔移植性VX2瘤的機制研究 目的:探討經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射CALE治療惡性實體腫瘤的作用機理。 材料與方法: 一、種植瘤模型制作新西蘭大白兔16只，種植瘤模型制作及監(jiān)測同第一部分相仿。 二、治療藥劑的配制及治療方法本部分使用CALE為治療藥劑：其配制、用法用量及治療方法同第一部分。 三、實驗分組及處理 1.分組及治療滿足治療條件的移植性VX2瘤模型兔16只，按瘤內(nèi)注射

10、CALE治療術(shù)后處死時間不同隨機分成4組，分別行經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射CALE(2ml／每瘤)。 2.術(shù)后觀察處理 ①觀察實驗兔經(jīng)皮瘤內(nèi)注射CALE術(shù)后反應(yīng)、活動及進食情況。 ②各組分別于治療術(shù)后30min、1d、7d及14d處死，解剖分離瘤灶取材固定。 ③7d組及14d組共8只治療兔，分別于注射CALE治療前、治療后7d抽取外周血備檢(檢測血常規(guī)、肝功能)。 四、統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS13.

11、0統(tǒng)計軟件，計量資料用mean±SD，治療前、后外周血指標比較采用配對T檢驗；P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: 一、動物模型制作及治療：與第一部分相仿。 二、術(shù)后觀察 (一)、各組實驗兔治療術(shù)后反應(yīng)、活動及進食情況與術(shù)前相比均無明顯變化。 (二)、病理動態(tài)變化 1.大體觀察治療后30miln組：瘤灶外觀顏色及質(zhì)地無明顯改變，中心切面注射區(qū)可見類圓失去光澤呈灰白色； 2.石蠟

12、切片HE染色治療后30min組，瘤組織水腫，局部微血管充血、擴張，瘤細胞腫脹。 3.冷凍切片蘇丹III染色瘤細胞核藍染，碘油呈鮮紅色。 4.透射電鏡30min組，瘤細胞呈大片溶解壞死，胞膜消失，細胞間邊界不清，細胞器正常結(jié)構(gòu)消失，胞漿內(nèi)或胞核周圍可見明顯“脂滴”樣空泡，核膜皺縮、模糊不清或消失，可見裸核，部分胞核染色質(zhì)異常聚集成團，部分胞核碎裂，核染色質(zhì)斷裂。 (三)、外周血血常規(guī)及肝功主要指標7d組及14d組共

13、8只治療兔，經(jīng)檢測外周血血常規(guī)(WBC、HGB及PLT)及肝功(TB和ALT)，統(tǒng)計比較示治療前及治療術(shù)后7天各主要指標無顯著性差異(均為P>0.05)。 結(jié)論: 經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射CALE消融的機制是： ①破壞了瘤細胞賴以生存的微環(huán)境，阻礙了癌細胞與組織液進行物質(zhì)交換，特別是養(yǎng)分和氧的獲取，引起細胞酸中毒，溶酶體膜破裂，DNA受損。同時引起脂質(zhì)崩解和細胞骨架的破壞，直至細胞死亡。 ②CALE局部存留及彌散

14、，可在一定范圍內(nèi)長期而持久地發(fā)揮其化療藥物及碘油的雙重的細胞毒性作用。 ③通過瘤細胞的吞飲作用，CALE內(nèi)攜帶的碘油和化療藥逐漸進入胞漿內(nèi)，進一步發(fā)揮化療藥的細胞毒作用，致其破裂溶解，進而發(fā)生核固縮、碎裂引起細胞壞死。 ④CALE可抑制腫瘤細胞和組織的PCNA和VEGF的生成和表達，從而有效抑制腫瘤組織的生長和侵襲。 第三部分：經(jīng)皮瘤內(nèi)注射CALE治療兔移植性VX2瘤的安全性評價 目的：結(jié)合前兩組評價經(jīng)皮

15、穿刺瘤內(nèi)注射CALE治療惡性實體瘤的安全可行性。 材料與方法： 1.分組及治療總共6只正常兔(未接種瘤株)，分別行經(jīng)皮穿刺雙側(cè)大腿肌肉內(nèi)(2只)、肝臟內(nèi)(2只)及腹腔內(nèi)(2只)注射CALE2ml。 2.術(shù)后觀察處理 ①觀察實驗兔術(shù)后反應(yīng)、活動及進食情況。 ②治療術(shù)后7天處死實驗兔，解剖分離標本，行大腿肌肉、肝臟及腹腔內(nèi)靶區(qū)病理學大體觀察。 ③注射區(qū)取材固定：行石蠟切片HE染色光鏡觀察。

16、 結(jié)果： 一、一般情況本組2只經(jīng)腹腔內(nèi)注射CALE者，術(shù)后3天內(nèi)反應(yīng)、活動及進食均較術(shù)前略差，后逐漸好轉(zhuǎn)，至7天時完全恢復正常。肝臟及大腿肌肉內(nèi)注射者術(shù)后實驗動物反應(yīng)、活動及進食情況與術(shù)前相比均無明顯變化。 二、CALE對正常組織的毒性觀察： 1.大體觀察 ①肝臟注射區(qū)：注射術(shù)后7天肝臟注射區(qū)外觀呈局限灰白色，與周圍肝組織分界較清楚，切面質(zhì)地軟化，可見境界較清灶性壞死，壞死區(qū)顏色變灰黃。 ②肌

17、肉注射區(qū)：注射術(shù)后7天肌肉外觀呈局限暗紅色、腫脹，質(zhì)地略變軟；切面可見境界較清灶性液化壞死，壞死區(qū)顏色暗紅。 ③腹腔內(nèi)腹膜及腸管未見明顯異常。 2.石蠟切片HE染色光鏡檢查 ①肝臟注射區(qū)肝小葉及肝板正常結(jié)構(gòu)形態(tài)破壞消失，細胞破裂溶解，注射區(qū)邊緣可見微血管充血、擴張，肝細胞腫脹、氣球樣變。 ②肌肉注射區(qū)注射區(qū)肌肉組織呈片狀壞死，肌細胞破裂溶解，肌纖維碎裂；邊緣區(qū)見肌細胞腫脹，部分肌纖維斷裂。 ③因腹