經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射碘油化療藥乳劑治療實(shí)驗(yàn)兔移植性VX2腫瘤的療效和機(jī)理研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分:經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射CALE治療兔移植性VX2瘤療效研究 目的:觀察經(jīng)皮穿刺局部注射CALE和其組成成分對(duì)兔移植性VX2腫瘤的治療效果，評(píng)價(jià)CALE和其組成成分的作用。 材料與方法: 一、種植瘤模型制作新西蘭大白兔14只，采用瘤細(xì)胞混懸液局部注射接種法，于左、右大腿肌肉內(nèi)穿刺接種VX2瘤株。行B超觀察種植瘤生長(zhǎng)情況，14～16天后瘤塊直徑達(dá)2cm以上瘤灶作為實(shí)驗(yàn)瘤模型。

2、二、治療藥劑的配制及治療方法本研究主要使用三種藥劑： ①單純碘油：超乳化碘油； ②化療藥物溶液：將阿霉素、絲裂霉素及卡鉑三種粉劑溶解于4ml非離子造影劑中； ③CALE：將阿霉素、絲裂霉素及卡鉑加入造影劑和碘化油(兩者體積比1:1)4ml內(nèi)，充分混勻乳化。 三、實(shí)驗(yàn)分組及處理 1.分組及治療滿足治療條件的移植性VX2瘤模型兔14只，按瘤灶內(nèi)注射藥物成份不同隨機(jī)分4組。 ①碘油組：4只8個(gè)瘤

3、灶，分別行經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)一次性注射超乳化碘油(2ml／瘤)。 ②化療藥物組：4只8個(gè)瘤灶，分別行經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)一次性注射化療藥物溶液(2ml／瘤)。 ③CALE組：4只8個(gè)瘤灶，分別經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)一次性注射CALE(2ml／瘤)。 ④對(duì)照組：2只4個(gè)瘤灶，未治療，作為病理對(duì)照。 2.術(shù)后觀察處理 ①觀察實(shí)驗(yàn)兔反應(yīng)、活動(dòng)及進(jìn)食情況。 ②治療術(shù)后7天處死實(shí)驗(yàn)兔，解剖分離瘤灶，觀察各組瘤體大體標(biāo)本、壞

4、死情況并計(jì)算腫瘤壞死率。 ③瘤灶取材固定：行病理學(xué)光鏡(HE染色)、電鏡觀察；以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組增殖細(xì)胞核抗原(prolifcratingcellnuclearantigens,PCNA)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrothfactor,VEGF)的表達(dá)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用mean±SD，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析(onew

5、ayANOVA)；P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 一、動(dòng)物模型制作及治療：VX2瘤株雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉內(nèi)接種成功率100％，接種16天，瘤灶大小平均2.3±0.25cm；B超顯示腫瘤血供豐富。在靜脈全麻及B超引導(dǎo)下行瘤塊局部穿刺及注藥，治療成功率100％。 二、術(shù)后觀察 (一)、一般情況各組實(shí)驗(yàn)兔治療術(shù)后反應(yīng)、活動(dòng)及進(jìn)食情況與術(shù)前相比均無(wú)明顯變化。 (二)、病理觀察 1.大體觀察

6、 ①對(duì)照組(未治療)：腫瘤外觀呈灰白色結(jié)節(jié)，類(lèi)圓形；切面呈灰紅色，鮮嫩呈魚(yú)肉樣，有光澤，無(wú)壞死。 ②經(jīng)皮瘤內(nèi)注射治療術(shù)后7d，經(jīng)治療之三組均有不同程度的治療改變。 ③壞死率：經(jīng)測(cè)量腫瘤壞死徑線，計(jì)算各組腫瘤壞死率分別為：碘油組：2.22±0.56％；化療藥物組：7.25±0.82％；CALE組：27.02±3.46％； 2.光鏡及電鏡觀察 (1)HE染色光鏡檢查對(duì)照組：VX2瘤組織病理切片見(jiàn)腫瘤呈浸

7、潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞排列紊亂，呈巢狀分布，胞核大而濃染，核質(zhì)顆粒粗，部分核呈異形，胞界不清。 (2)透射電鏡觀察對(duì)照組：VX2瘤腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核增大，核漿比增大，核形狀可見(jiàn)異形，核周濃染，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整。 3.瘤組織PCNA及VEGF免疫組織化學(xué)法表達(dá)PCNA陽(yáng)性染色為細(xì)胞核膜周?chē)昂藘?nèi)被染成黃色或棕黃色，呈顆粒狀或彌漫，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞呈彌漫性、片狀或散在分布，PCNA分別為

8、對(duì)照組76.50±1.67％。 結(jié)論: 1.制作大腿內(nèi)側(cè)肌肉內(nèi)移植性兔VX2模型簡(jiǎn)單，成功率高，血供較豐富，類(lèi)似人類(lèi)結(jié)節(jié)型惡性實(shí)體癌瘤，位置表淺便于觀察及治療等實(shí)驗(yàn)研究。B超是一種簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)查監(jiān)測(cè)手段。 2.采用經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射局部消融的方法，單純碘油和化療藥物對(duì)腫瘤均有一定的治療作用；CALE提高了藥物在局部存留的時(shí)間和濃度，增強(qiáng)了局部消融強(qiáng)度，可引起明顯的腫瘤組織壞死，治療效果最明顯。 第二部分

9、：經(jīng)皮瘤內(nèi)注射CALE治療兔移植性VX2瘤的機(jī)制研究 目的:探討經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射CALE治療惡性實(shí)體腫瘤的作用機(jī)理。 材料與方法: 一、種植瘤模型制作新西蘭大白兔16只，種植瘤模型制作及監(jiān)測(cè)同第一部分相仿。 二、治療藥劑的配制及治療方法本部分使用CALE為治療藥劑：其配制、用法用量及治療方法同第一部分。 三、實(shí)驗(yàn)分組及處理 1.分組及治療滿足治療條件的移植性VX2瘤模型兔16只，按瘤內(nèi)注射

10、CALE治療術(shù)后處死時(shí)間不同隨機(jī)分成4組，分別行經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射CALE(2ml／每瘤)。 2.術(shù)后觀察處理 ①觀察實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)皮瘤內(nèi)注射CALE術(shù)后反應(yīng)、活動(dòng)及進(jìn)食情況。 ②各組分別于治療術(shù)后30min、1d、7d及14d處死，解剖分離瘤灶取材固定。 ③7d組及14d組共8只治療兔，分別于注射CALE治療前、治療后7d抽取外周血備檢(檢測(cè)血常規(guī)、肝功能)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.

11、0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用mean±SD，治療前、后外周血指標(biāo)比較采用配對(duì)T檢驗(yàn)；P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 一、動(dòng)物模型制作及治療：與第一部分相仿。 二、術(shù)后觀察 (一)、各組實(shí)驗(yàn)兔治療術(shù)后反應(yīng)、活動(dòng)及進(jìn)食情況與術(shù)前相比均無(wú)明顯變化。 (二)、病理動(dòng)態(tài)變化 1.大體觀察治療后30miln組：瘤灶外觀顏色及質(zhì)地?zé)o明顯改變，中心切面注射區(qū)可見(jiàn)類(lèi)圓失去光澤呈灰白色； 2.石蠟

12、切片HE染色治療后30min組，瘤組織水腫，局部微血管充血、擴(kuò)張，瘤細(xì)胞腫脹。 3.冷凍切片蘇丹III染色瘤細(xì)胞核藍(lán)染，碘油呈鮮紅色。 4.透射電鏡30min組，瘤細(xì)胞呈大片溶解壞死，胞膜消失，細(xì)胞間邊界不清，細(xì)胞器正常結(jié)構(gòu)消失，胞漿內(nèi)或胞核周?chē)梢?jiàn)明顯“脂滴”樣空泡，核膜皺縮、模糊不清或消失，可見(jiàn)裸核，部分胞核染色質(zhì)異常聚集成團(tuán)，部分胞核碎裂，核染色質(zhì)斷裂。 (三)、外周血血常規(guī)及肝功主要指標(biāo)7d組及14d組共

13、8只治療兔，經(jīng)檢測(cè)外周血血常規(guī)(WBC、HGB及PLT)及肝功(TB和ALT)，統(tǒng)計(jì)比較示治療前及治療術(shù)后7天各主要指標(biāo)無(wú)顯著性差異(均為P>0.05)。 結(jié)論: 經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射CALE消融的機(jī)制是： ①破壞了瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的微環(huán)境，阻礙了癌細(xì)胞與組織液進(jìn)行物質(zhì)交換，特別是養(yǎng)分和氧的獲取，引起細(xì)胞酸中毒，溶酶體膜破裂，DNA受損。同時(shí)引起脂質(zhì)崩解和細(xì)胞骨架的破壞，直至細(xì)胞死亡。 ②CALE局部存留及彌散

14、，可在一定范圍內(nèi)長(zhǎng)期而持久地發(fā)揮其化療藥物及碘油的雙重的細(xì)胞毒性作用。 ③通過(guò)瘤細(xì)胞的吞飲作用，CALE內(nèi)攜帶的碘油和化療藥逐漸進(jìn)入胞漿內(nèi)，進(jìn)一步發(fā)揮化療藥的細(xì)胞毒作用，致其破裂溶解，進(jìn)而發(fā)生核固縮、碎裂引起細(xì)胞壞死。 ④CALE可抑制腫瘤細(xì)胞和組織的PCNA和VEGF的生成和表達(dá)，從而有效抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)和侵襲。 第三部分：經(jīng)皮瘤內(nèi)注射CALE治療兔移植性VX2瘤的安全性評(píng)價(jià) 目的：結(jié)合前兩組評(píng)價(jià)經(jīng)皮

15、穿刺瘤內(nèi)注射CALE治療惡性實(shí)體瘤的安全可行性。 材料與方法： 1.分組及治療總共6只正常兔(未接種瘤株)，分別行經(jīng)皮穿刺雙側(cè)大腿肌肉內(nèi)(2只)、肝臟內(nèi)(2只)及腹腔內(nèi)(2只)注射CALE2ml。 2.術(shù)后觀察處理 ①觀察實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后反應(yīng)、活動(dòng)及進(jìn)食情況。 ②治療術(shù)后7天處死實(shí)驗(yàn)兔，解剖分離標(biāo)本，行大腿肌肉、肝臟及腹腔內(nèi)靶區(qū)病理學(xué)大體觀察。 ③注射區(qū)取材固定：行石蠟切片HE染色光鏡觀察。

16、 結(jié)果： 一、一般情況本組2只經(jīng)腹腔內(nèi)注射CALE者，術(shù)后3天內(nèi)反應(yīng)、活動(dòng)及進(jìn)食均較術(shù)前略差，后逐漸好轉(zhuǎn)，至7天時(shí)完全恢復(fù)正常。肝臟及大腿肌肉內(nèi)注射者術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)、活動(dòng)及進(jìn)食情況與術(shù)前相比均無(wú)明顯變化。 二、CALE對(duì)正常組織的毒性觀察： 1.大體觀察 ①肝臟注射區(qū)：注射術(shù)后7天肝臟注射區(qū)外觀呈局限灰白色，與周?chē)谓M織分界較清楚，切面質(zhì)地軟化，可見(jiàn)境界較清灶性壞死，壞死區(qū)顏色變灰黃。 ②肌

17、肉注射區(qū)：注射術(shù)后7天肌肉外觀呈局限暗紅色、腫脹，質(zhì)地略變軟；切面可見(jiàn)境界較清灶性液化壞死，壞死區(qū)顏色暗紅。 ③腹腔內(nèi)腹膜及腸管未見(jiàn)明顯異常。 2.石蠟切片HE染色光鏡檢查 ①肝臟注射區(qū)肝小葉及肝板正常結(jié)構(gòu)形態(tài)破壞消失，細(xì)胞破裂溶解，注射區(qū)邊緣可見(jiàn)微血管充血、擴(kuò)張，肝細(xì)胞腫脹、氣球樣變。 ②肌肉注射區(qū)注射區(qū)肌肉組織呈片狀壞死，肌細(xì)胞破裂溶解，肌纖維碎裂；邊緣區(qū)見(jiàn)肌細(xì)胞腫脹，部分肌纖維斷裂。 ③因腹