我國(guó)部分種雞群REV感染血清學(xué)調(diào)查與亞單位疫苗探索.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒感染不僅能夠引起雞發(fā)生腫瘤和嚴(yán)重的免疫抑制，還常常污染弱毒疫苗，并可通過(guò)垂直傳播造成雞群禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒較高的感染率。目前除了檢測(cè)和淘汰外，尚無(wú)有效商品化疫苗可以用于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒的控制。此外，在科學(xué)研究中，由于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒與人的獲得性免疫缺陷綜合征病毒具有非常相似的基因組結(jié)構(gòu)，還常常被用于作為一種模式病毒來(lái)研究逆轉(zhuǎn)錄病毒的分子生物學(xué)機(jī)制特征，如病毒的準(zhǔn)種演變機(jī)制等。為了摸清我國(guó)大型種雞場(chǎng)和

2、某些地方品系雞中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒的流行狀況，本研究利用血清學(xué)方法調(diào)查了我國(guó)部分大型種雞場(chǎng)的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒的感染情況，并通過(guò)某一特定雞群觀察了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒在雞群中的準(zhǔn)種多樣性，對(duì)于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒亞單位疫苗的研制做了嘗試和探索。摘要如下:
　　1.我國(guó)部分種雞場(chǎng)REV感染的血清學(xué)調(diào)查
　　為了調(diào)查我國(guó)部分大型種雞場(chǎng)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒感染的狀況，本研究從我國(guó)4個(gè)曾祖代雞場(chǎng)采集了536份血清樣本，

3、從8個(gè)祖代雞場(chǎng)采集了6557份血清樣品，從4個(gè)父母代雞場(chǎng)采集了312份血清樣品，對(duì)列入我國(guó)地方品系雞保種基因庫(kù)的20種地方品系雞共采集了1306份血清樣品。所有采集的血清樣品采用ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)REV抗體，對(duì)出現(xiàn)讀數(shù)但判定為陰性的輔助IFA進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估這些大型種雞場(chǎng)的REV感染狀況。結(jié)果顯示在曾祖代、祖代和父母代中所檢測(cè)的REV抗體陽(yáng)性率分別為0-31％，0-47％，4.23-42.50％。地方品系雞總計(jì)1306份血清樣

4、品中有高達(dá)746份血清樣品經(jīng)ELISA和IFA檢測(cè)均為REV抗體陽(yáng)性，抗體陽(yáng)性率為57.12％;所有雞群均有不同程度的感染，陽(yáng)性率最高達(dá)到100％。
　　基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，種雞群隨著代次的升高感染率顯著降低，不同代次的外來(lái)品系種雞感染率顯著高于地方品種，種雞開(kāi)產(chǎn)前感染率高于開(kāi)產(chǎn)后感染率。
　　外來(lái)品系經(jīng)ELISA鑒定為陽(yáng)性的血清樣品經(jīng)IFA鑒定均為陽(yáng)性，但是某些經(jīng)ELISA檢測(cè)其讀數(shù)的OD值在臨界值附近的血清樣品經(jīng)IFA

5、檢測(cè)可見(jiàn)典型的綠色熒光，也可判定為REV抗體陽(yáng)性，顯示IFA比ELISA在REV抗體結(jié)果判定上靈敏度更高一些。本調(diào)查表明，RVE感染在我國(guó)某些大型種禽場(chǎng)中是比較普遍的，在我國(guó)傳統(tǒng)的地方品系基因庫(kù)中感染尤其嚴(yán)重，應(yīng)該引起高度重視。
　　2.同一雞群不同個(gè)體中REV的分離鑒定與準(zhǔn)種多樣性比較
　　對(duì)某雞場(chǎng)發(fā)生腫瘤病例的某海蘭褐種雞群隨機(jī)抽取8只雞，無(wú)菌采集抗凝血接種雞胚成纖維細(xì)胞和DF-1細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)MDV、ALV和REV的分離

6、和鑒定，最終分離到4株REV野毒，分別定名為HB1201、HB1202、HB1203、HB1204。
　　對(duì)4株REV進(jìn)行env基因的擴(kuò)增和克隆，每個(gè)毒株選取10個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序和序列分析，以env基因分析和比較4個(gè)毒株的準(zhǔn)種差異。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HB1201-HB1204四個(gè)毒株的env基因全長(zhǎng)均為1761bp，編碼587個(gè)氨基酸，4個(gè)毒株其env基因的10個(gè)克隆子之間核酸同源性分別為99.6％-100％、99.7％-100％、9

7、9.7％-100％、99.7％-100％，其準(zhǔn)種群體中優(yōu)勢(shì)變種比例分別為20％(4/10)、30％(3/10)、60％(6/10)、30％(3/10)，顯示不同個(gè)體感染REV后優(yōu)勢(shì)變種比例具有明顯差異。
　　對(duì)4個(gè)毒株的優(yōu)勢(shì)變種分析發(fā)現(xiàn)，HB1201、HB1202、HB1203的三個(gè)毒株的優(yōu)勢(shì)變種env基因相互之間為100％同源，表明這3只雞感染REV后的優(yōu)勢(shì)變種是一致的，但比例有所差異;HB1204與上述3株REV相比其優(yōu)勢(shì)變種

8、的env基因共有2個(gè)核酸位點(diǎn)發(fā)生了變化并引起了2個(gè)推導(dǎo)氨基酸位點(diǎn)的改變，顯示同一雞群中REV的優(yōu)勢(shì)變種在不同個(gè)體中發(fā)生了變化。
　　通過(guò)對(duì)4個(gè)毒株的優(yōu)勢(shì)變種與以前不同年份發(fā)表的參考序列比較發(fā)現(xiàn)，env基因同源性在94.7％-100％之間，說(shuō)明REV優(yōu)勢(shì)變種穩(wěn)定性總體較高，但準(zhǔn)種群體內(nèi)仍發(fā)生變異，保持動(dòng)態(tài)變化。
　　3.REV-env蛋白與不同C3d分子串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建及亞單位疫探索
　　為了探索研制能夠有效誘發(fā)雞體R

9、EV中和抗體的REV亞單位疫苗，本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件模擬并選取了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒env基因一段抗原決定簇集中的1050bp的片段作為抗原蛋白目標(biāo)基因。
　　為了增強(qiáng)其免疫效果，本研究利用RT-PCR的方法從雞肝臟中擴(kuò)增獲得雞C3d基因，并分別將2，3和4個(gè)C3d分子與雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒env-1050片段連接，經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后與原核表達(dá)載體PET-30a連接構(gòu)建了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒env蛋白與不同C3d分

10、子串聯(lián)表達(dá)的原核表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果均顯示PET-30a-env-1050、PET-env-1050-2C3d和PET-env-1050-3C3d均獲得成功表達(dá)，但PET-env-1050-4C3d未能表達(dá)，可能是由于片段較長(zhǎng)的原因。鎳柱親和純化結(jié)果顯示純化蛋白符合預(yù)期大小，純度約為90％。
　　本研究將REV env-1050分別與2;3和4個(gè)C3d分子連接;經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶

11、切后與表達(dá)載體pCDNA-FLAG連接構(gòu)建了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒env-1050與不同C3d分子串聯(lián)表達(dá)的真核表達(dá)載體，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果均顯示構(gòu)建的真核表達(dá)載體pCDNA-FLAG-env-1050、pCDNA-FLAG-1050-2C3d、pCDNA-FLAG-env-1050-3 C3d和pCDNA-FLAG-env-1050-4C3d均獲得了成功表達(dá)。
　　將上述原核表達(dá)蛋白和真核表達(dá)蛋白經(jīng)純