抗菌性骨缺損修復(fù)材料的理化與生物學(xué)性能實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、最為理想的生物材料就是機(jī)體自身的組織,天然生物材料經(jīng)過(guò)億萬(wàn)年的演變進(jìn)化,形成具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜精巧、效能奇妙多彩的功能原理和作用機(jī)制。新鮮自體骨是由無(wú)機(jī)材料和有機(jī)材料巧妙地結(jié)合在一起形成的復(fù)合體,其中無(wú)機(jī)材料的大部分是羥基磷灰石結(jié)晶,具有較高的骨誘導(dǎo)性,無(wú)免疫排斥反應(yīng),但是會(huì)增加手術(shù)創(chuàng)傷,并且病人還會(huì)出現(xiàn)局部疼痛、感覺(jué)異?；蜻^(guò)敏等并發(fā)癥,骨的來(lái)源也十分有限。近年來(lái),利用組織工程化骨修復(fù)骨缺損,不僅提供了一種修復(fù)骨缺損的方法,而且也提供了一種全

2、新思路,骨組織工程學(xué)的研究為治療骨缺損帶來(lái)了新的希望。目前,體外構(gòu)建的組織工程化人工骨雖然還停留在實(shí)驗(yàn)室及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,但隨著細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)、免疫學(xué)、材料學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,骨組織工程學(xué)的研究也將會(huì)取得突破性進(jìn)展,在工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用上有著極其廣闊的應(yīng)用前景,它將會(huì)成為21世紀(jì)極具發(fā)展?jié)摿Φ母咝录夹g(shù)產(chǎn)業(yè),蘊(yùn)藏著巨大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。作為人類骨組織的主要無(wú)機(jī)成分,羥基磷灰石生物陶瓷價(jià)廉易得,具有良好的生物相容性,可降解又具備骨引導(dǎo)、

3、骨融合性,尤其是含孔的珊瑚羥基磷灰石可提供很大的表面積/體積比,能保證細(xì)胞的增殖、分化和高代謝活動(dòng),所以特別適合用于骨組織工程。隨著現(xiàn)代工業(yè)化機(jī)械化程度的提高,由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤、事故、戰(zhàn)爭(zhēng)、地震等所致的大量污染性骨缺損發(fā)生率大幅度升高。對(duì)其傳統(tǒng)治療方法,即先清創(chuàng)、待傷口關(guān)閉、無(wú)感染跡象3～6個(gè)月后、再行二期植骨修復(fù)；而一期植骨常因發(fā)生較高的感染率而被視為禁忌,且臨床上細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題日益嚴(yán)重,植骨材料加載抗生素的作用越來(lái)越局限化,對(duì)

4、抗菌劑提出了更高的要求。為解決傳統(tǒng)治療方法所帶來(lái)的增加治療時(shí)間、難度、患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等一系列問(wèn)題,改變傳統(tǒng)觀念,近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者在抗菌骨移植材料的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐方面進(jìn)行了大量的研究,取得了一定的進(jìn)展。為此,我們研制一種抗菌性骨支架修復(fù)材料,并經(jīng)以下系列實(shí)驗(yàn)研究證明:這一抗菌性骨修復(fù)材料具有良好的生物相容性,可在局部緩釋銀離子,有效地抑制污染性骨缺損清創(chuàng)術(shù)后局部殘留的細(xì)菌。
　　 實(shí)驗(yàn)分四個(gè)部分進(jìn)行觀察研究:
　

5、　 課題研究第一部分:載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨的制備及性能表征。
　　 目的:制備載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨并觀察其理化性能表征。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)于2008-05/08在清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)材料:在加工好的珊瑚羥基磷灰石(Coral Hydroxyapatite,CHA)顆粒與相應(yīng)濃度硝酸銀(Silver nitrate,AgNO3)溶液浸泡一定時(shí)間后置入凍干機(jī)凍干制得載銀珊瑚羥基磷灰石(Silve

6、r-loaded Coral Hydroxyapatite,SLCHA或Ag+-CHA)。應(yīng)用X射線衍射法對(duì)Ag+-CHA、CHA和純珊瑚樣品晶體的物相、結(jié)構(gòu)和位相進(jìn)行分析；應(yīng)用FT-IR光譜法對(duì)樣品的材料組成進(jìn)行分析；應(yīng)用掃描電鏡觀察材料的顯微形貌和孔徑；利用壓縮試驗(yàn)及三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)評(píng)價(jià)骨修復(fù)支架材料的機(jī)械性能。應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)機(jī)械性能測(cè)試結(jié)果行單向方差分析及LSD法兩兩比較(α=0.05)。
　　 結(jié)論:珊瑚羥基磷灰

7、石經(jīng)載銀后未改變其理化性能,依然維持著三維多孔框架結(jié)構(gòu)；制備原理主要為鈣銀離子之間的置換反應(yīng),其次為銀離子的溶出-沉積反應(yīng),并且隨著制備過(guò)程中硝酸銀溶液濃度的遞增,Ag+-CHA的載銀量也隨之遞增。
　　 課題研究第二部分:載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨的載銀量及體外緩釋實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:研制載銀珊瑚羥基磷灰石抗菌性人工骨支架材料,通過(guò)對(duì)其自身載銀量及體外緩釋實(shí)驗(yàn)完善對(duì)該抗菌性磷灰石類復(fù)合人工骨的認(rèn)識(shí)。
　　 方法

8、:應(yīng)用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(inductively coupled plasma opticalemission spectrometry,ICP-OES)測(cè)定載銀材料中銀的平均含量,并在模擬體液(Stimulated body fluid,SBF,pH=7.25)中通過(guò)體外釋放試驗(yàn)測(cè)定銀離子釋放濃度與時(shí)間的變化曲線,探討材料結(jié)構(gòu)與釋放銀的關(guān)聯(lián)性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,用相關(guān)回歸分析和曲線擬合載銀量與AgNO3濃

9、度關(guān)系曲線,建立回歸方程。
　　 結(jié)論:載銀珊瑚羥基磷灰石之所以能保持長(zhǎng)時(shí)間的銀離子釋放,與羥基磷灰石本身的空間晶格結(jié)構(gòu)關(guān)系密切,這種可逆的離子置換過(guò)程使其釋放性能更顯著,能更有效地避免銀離子突釋,保持長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)釋放,有效地減少金屬銀的使用量,達(dá)到減毒增效的作用。
　　 課題研究第三部分:載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨的細(xì)胞相容性研究
　　 目的:研制載銀珊瑚羥基磷灰石抗菌性人工骨支架材料,觀察其在體外與小鼠胚胎成骨

10、細(xì)胞株(MC3T3-E1)的細(xì)胞相容性。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)于2009-06/09在廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科完成。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),將MC3T3-E1細(xì)胞種植于10-3、8×10-5、10-5 mol/L,Ag+-CHA,CHA及純珊瑚支架材料上。實(shí)驗(yàn)評(píng)估:①M(fèi)TT法測(cè)定MC3T3-E1細(xì)胞接種在不同支架材料上生長(zhǎng)1,3,5d后的吸光光度值,繪制細(xì)胞在不同骨材料上的生長(zhǎng)曲線,評(píng)價(jià)材料上細(xì)胞的增殖情況；②堿性磷酸酶(ALP)活性

11、法測(cè)定細(xì)胞接種在不同支架材料上2,4,6d的吸光光度值,計(jì)算培養(yǎng)液中堿性磷酸酶值；③倒置相差顯微鏡下直接觀察培養(yǎng)板上MC3T3-E1細(xì)胞的生長(zhǎng)形貌；④應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscopes,CLSM)直接觀察支架材料上MC3T3-E1細(xì)胞的生長(zhǎng)形貌；⑤應(yīng)用掃描電鏡(SEM)觀察細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)的微觀形貌。應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)各框架材料上的細(xì)胞生長(zhǎng)情況結(jié)果行析因方差分析及LSD

12、法兩兩比較,(α=O.05)。
　　 結(jié)論:通過(guò)MTT、ALP活性、倒置相差顯微鏡、激光共聚焦及掃描電鏡全方位多角度觀察了細(xì)胞在天然框架材料上的反應(yīng)。細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)良好,表明材料具有良好的細(xì)胞相容性。MTT、ALP活性的定量結(jié)果表明低載銀量珊瑚羥基磷灰石材料與非載銀骨替代材料的生物相容性基本一致。
　　 課題研究第四部分:載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨修復(fù)兔橈骨污染性骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該

13、抗菌性人工骨植入動(dòng)物體內(nèi)的組織相容性、骨傳導(dǎo)性和材料的生物降解等組織自愈合生物學(xué)性能。
　　 方法:新西蘭大白兔36只,隨機(jī)分為4組,每組9只。選用新西蘭大白兔制作兔橈骨15mm節(jié)段性污染性骨與骨膜缺損模型,將36只大白兔稱重,按體重大小順序編號(hào),按隨機(jī)數(shù)目表法隨機(jī)分為A～D組。A組植入載銀珊瑚羥基磷灰石材料；B組植入珊瑚羥基磷灰石材料；C組植入原位自體骨材料；D組無(wú)任何植入,做為對(duì)照組。分別于術(shù)后2,6,10周分三次處死動(dòng)物取

14、材,每次每組3只,通過(guò)大體觀察、影像學(xué)檢查、組織學(xué)檢查觀察比較各組骨缺損修復(fù)情況,應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)X線觀察結(jié)果行重復(fù)測(cè)量方差分析及LSD法兩兩比較,α=0.05,比較上述各組對(duì)大段骨缺損的修復(fù)作用。
　　 結(jié)果:不同組材料對(duì)骨缺損修復(fù)的大體觀察結(jié)果可見(jiàn)2w時(shí)A、B兩組移植物表面有肉芽組織和部分半透明骨質(zhì)覆蓋,與宿主骨斷端間有部分骨痂連接,移植物無(wú)明顯移位；C組移植物與宿主骨有部分骨痂連接,移植物無(wú)活動(dòng)；D組骨缺損區(qū)填充

15、以肌纖維組織。6w時(shí)A、B兩組移植物表面有薄層骨質(zhì)覆蓋,與宿主骨斷端間有大量骨痂連接,較穩(wěn)固；C組移植物與宿主骨皮質(zhì)連續(xù),但不均勻,移植物無(wú)明顯移位；D組缺損區(qū)仍填充以肌纖維組織。10w時(shí)A、B兩組移植物表面有明顯連續(xù)骨質(zhì)覆蓋,移植物穩(wěn)固；C組移植物與宿主骨皮質(zhì)連續(xù)成一體；D組缺損區(qū)仍填充以肌纖維組織。X線檢查結(jié)果可見(jiàn)不同時(shí)間點(diǎn)各組之間比較有顯著性差異(F=11.537,P=0.000)；自體骨成骨情況最好,與其他各組之間比較有顯著性差

16、異(P值分別為0.004、0.010、0.000),說(shuō)明自體骨組織在大段骨缺損修復(fù)時(shí)仍然是最好的材料；Ag+-CHA組與CHA組兩組比較無(wú)顯著性差異(P 值分別為0.524),說(shuō)明珊瑚羥基磷灰石經(jīng)一定量載銀后其成骨作用未受明顯影響；對(duì)照組與其他各組之間比較有顯著性差異(P=0.000、0.000、0.000),說(shuō)明污染性兔橈骨大段骨缺損后其成骨作用明顯受到抑制,其模型制作是成功的。
　　 結(jié)論:根據(jù)仿生的思路和以往對(duì)骨修復(fù)框架材

17、料的研究,我們制備了一種新型的抗菌性框架材料用于污染性骨缺損修復(fù)。此材料成分和結(jié)構(gòu)均與天然骨無(wú)機(jī)成分有相似性,多孔結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨類似。通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),證明了此材料具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性,是有效的骨修復(fù)框架材料,可以達(dá)到與自體骨材料相同的效果,有希望成為污染性骨缺損修復(fù)的優(yōu)選材料,具有廣闊的市場(chǎng)前景。
　　 綜上所述,抗菌性載銀珊瑚羥基磷灰石骨替代材料的制備過(guò)程簡(jiǎn)單,抗菌劑銀離子的緩釋性能較為理想,在污染性大段骨缺損處有良