α1抗胰蛋白酶與肺癌易感性及其對肺癌生物學(xué)行為影響機制的研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。在我國城市居民癌癥死亡人群中，肺癌高居首位。盡管近30年來隨著基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對肺癌的診斷及治療水平有了很大提高，但對其發(fā)生發(fā)展的認識以及治療的效果遠未達到令人滿意的程度。目前認為癌癥是一種多基因疾病，環(huán)境與遺傳因素相互作用導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生發(fā)展，在注意環(huán)境因素預(yù)防的同時，對癌癥相關(guān)基因的研究已成為二十一世紀癌癥研究的熱點。
　　α1抗胰蛋白酶是一種重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑。研究顯示

2、在白種人群中，α1AT缺乏和慢性阻塞性肺疾病及肺癌有關(guān)聯(lián)。在白種人群中和肺癌易感性有關(guān)聯(lián)的Z、S基因型，據(jù)報告在我國漢族人群中很少見。目前α1AT基因多態(tài)性和我國漢族人群肺癌易感性的關(guān)系尚無定論。α1AT在多種腫瘤細胞中有表達，研究提示α1AT和癌癥預(yù)后似有一定的相關(guān)性。有關(guān)α1AT與肺癌預(yù)后關(guān)系的研究尚未見報告，有待探索。
　　研究目的：研究在我國陜西地區(qū)居住的漢族人群中α1AT基因多態(tài)性和肺癌易感性關(guān)系；探討α1AT在肺癌組織

3、中的表達與肺癌生物學(xué)行為之間的關(guān)系及可能機制；研究α1AT對人肺腺癌細胞系A(chǔ)549生長的影響及可能機制。
　　研究方法：
　　1.采集陜西地區(qū)居住的漢族人血標(biāo)本330例，包括肺癌組130例，COPD組100例，對照組100例。采用PCR-RFLP技術(shù)，篩查α1AT基因外顯子Ⅴ、Ⅲ及3’端突變體出現(xiàn)的頻率，分析其與肺癌的關(guān)系。
　　2.收集肺癌組織標(biāo)本107例，其中鱗癌45例，腺癌42例，小細胞癌20例。用免疫組化SP法

4、檢測α1AT、CD3、Fas、FasL、DcR3的表達，分析α1AT與肺癌的組織類型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并分析α1AT與CD3、Fas、FasL、DcR3表達的相關(guān)性，探討作用機制。
　　3.培養(yǎng)人肺癌細胞系A(chǔ)549，采用RT-PCR的方法克隆人α1AT基因編碼區(qū)cDNA，構(gòu)建α1AT的真核表達載體；用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A549細胞，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系；繪制生長曲線，AnnexinV法及Hoechst法檢

5、測細胞凋亡。應(yīng)用RT-PCR、Westernblot法分別檢測α1AT、Fas、FasL、DcR3的mRNA和蛋白表達的變化；探討α1AT的過表達對A549細胞生長與凋亡的影響，及對Fas、FasL、DcR3表達的作用。
　　實驗結(jié)果：
　　1.檢測到α1AT的Z、S基因型存在，但在肺癌組、COPD組、對照組中分布無明顯差異；非小細胞肺癌組發(fā)現(xiàn)3’端突變體（3m型基因）28例（21.5％），COPD組7例（7％），均明顯高于

6、對照組，統(tǒng)計學(xué)分析顯示肺癌組、COPD組與對照組之間3m型基因分布差異顯著（P=0.000）；將肺癌組進一步分組分析發(fā)現(xiàn)肺癌合并COPD組3’端突變體出現(xiàn)率42％，遠高于肺癌不合并COPD組（8％）；3m型基因陽性患者罹患NSCLC合并COPD的OR值為7.552。
　　2.鱗癌、腺癌、小細胞癌α1AT的陽性率分別為80.0％、76.2％、40.0％，α1AT的陽性強度檢驗顯示鱗癌、腺癌無明顯差異，但二者與小細胞肺癌比較差異顯著；

7、非小細胞肺癌臨床分期越晚、細胞分化程度越低、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則α1AT蛋白表達也越低。
　　3.非小細胞肺癌組織中α1AT蛋白表達越高，CD3陽性表達就越高，即腫瘤浸潤淋巴細胞數(shù)量就越多。
　　4.非小細胞肺癌組織中α1AT蛋白的高表達，伴隨Fas、FasL的高表達和DcR3的低表達，α1AT和Fas、FasL成正相關(guān)，和DcR3成負相關(guān)，相關(guān)檢驗有顯著性。
　　5.構(gòu)建成功α1AT真核表達載體，并成功轉(zhuǎn)染A549細胞

8、，獲得高表達α1AT的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細胞株。
　　6.體外培養(yǎng)狀態(tài)下，轉(zhuǎn)染α1AT的A549細胞生長緩慢，生長曲線低平，AnnexinV及Hoechst凋亡檢測提示，轉(zhuǎn)染α1AT的A549細胞凋亡增加，與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體的A549細胞相比，有顯著差異(P<0.01)。
　　7.RT-PCR、Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染α1AT真核表達載體的A549細胞α1AT的表達明顯增加，α1AT在轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平都上調(diào)Fa

9、s、FasL的表達，下調(diào)DcR3的表達。
　　結(jié)論：
　　1.α1AT的Z、S基因型在陜西地區(qū)居住的漢族人群中存在，發(fā)生率并不似國內(nèi)報告的那么低，但它們和漢族人群COPD及肺癌無明確的相關(guān)性；而3’端突變體在COPD和肺癌患者中明顯增多，是COPD和肺癌的易感因素。攜帶3’端突變體的人群患肺癌合并COPD的危險性明顯增高，提示α1AT的3’端突變體和漢族人群中肺癌的易感性相關(guān)。
　　2.鱗癌、腺癌組織中α1AT蛋白表達

10、陽性率明顯高于小細胞肺癌；非小細胞肺癌臨床分期越晚、細胞分化程度越低、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則α1AT蛋白表達也越低。表明α1AT蛋白表達在NSCLC中高于SCLC，且與病期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；提示α1AT蛋白有可能作為判斷肺癌的分期和預(yù)后的分子指標(biāo)。
　　3.α1AT高表達的非小細胞肺癌組織中CD3表達也高，表明α1AT能促進腫瘤部位CD3陽性的腫瘤浸潤淋巴細胞數(shù)量。提示α1AT蛋白的表達同樣是反映肺癌患者機體抗腫瘤免疫狀態(tài)的指標(biāo)

11、,有望用于臨床指導(dǎo)治療及判斷預(yù)后。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示α1AT可上調(diào)Fas、FasL表達，下調(diào)DcR3的表達。表明α1AT的表達在抑制肺癌細胞的生長，并促進其凋亡中起著重要作用。
　　5.成功構(gòu)建了α1AT真核表達載體，并成功轉(zhuǎn)染A549細胞，獲得高表達α1AT的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細胞株。為體外研究α1AT對肺癌細胞的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　6.體外培養(yǎng)狀態(tài)下，α1AT的過表達明顯抑制肺癌細胞A549的增殖、促進癌