碳離子硅橡膠改性材料的表面性能及其細胞相容性評價.pdf

1、研究背景和目的：
　　在整形外科領域,主要依靠植入軟組織填充材料來修復體表組織器官的畸形或缺損。硅橡膠(Siliconerubber,SR)因其具有良好的理化穩(wěn)定性及加工性能,目前仍是臨床上最常用的軟組織填充材料。但SR材料表面呈現強烈的疏水性,使其與人體組織親和力較差,可導致一系列臨床副反應。因此,選擇合適的改性處理方式對硅橡膠材料進行改性,不僅可以提高其臨床治療效果,而且對于研究細胞生物學行為與材料學特性之間的關系都有著意義。

2、據文獻報道,在對硅橡膠進行表面改性的研究方法中,有接枝共聚、仿生涂層等方法,但因均存在一些問題,限制了硅橡膠的表面改性效果。如:接枝共聚法,是通過化學反應在聚合物活化的基礎上引入特定化學基團,整個過程不僅步驟繁瑣,而且形成的化學基團不穩(wěn)定等因素影響了其改性效果;仿生涂層法,是通過噴涂、濺射等方法,在保持材料本身特性的基礎上,覆上一層生物活性物質在材料表面,這種改性方法也存在步驟較為繁瑣、難控制操作條件等問題,限制了它的推廣應用。

3、　　于是,我們在前期工作基礎上,嘗試將離子注入技術用于有機高分子材料表面改性。離子注入技術以往多用于金屬與合金材料的改性,它可選擇不同的離子源進行注入改性,在改性材料表面形成微圖形結構,使材料表面微觀結構發(fā)生改變,但并不影響基體材料本身的性質,對于硅橡膠的表面改性具有較好的可行性。于是,在本研究中,我們采用了人體的組成性元素碳(C)對硅橡膠表面進行注入處理,得到碳-硅橡膠(Carbonionimplantedsiliconerubber

4、,C-SR)。對改性后的材料采用掃描電鏡(Scanningelectronmicroscope,SEM)、原子力顯微鏡(AtomicForceMicroscope,AFM)、傅立葉紅外光譜(Fouriertransforminfraredspectrometer,FTIR)觀察材料表面的微觀形貌情況;通過X射線光電子能譜(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)、X射線衍射(X-raydiffraction

5、,XRD)等技術檢測分析了改性材料表面的物理化學性能狀態(tài);同時采取了一系列試驗對改性材料的細胞相容性進行了分析和評價。以期能制備出一種符合臨床需要,且副反應較少的新型軟組織填充材料。
　　研究方法：
　　本研究分為四部分:
　　第一部分:SR和碳-硅橡膠(C-SR)材料的制備及微觀形貌觀察
　　1.選用室溫硫化雙組份醫(yī)用液態(tài)硅橡膠制備普通硅橡膠,室溫固化完全后選擇表面平整光滑、無缺損、無明顯雜質的材料,選擇三種離

6、子注入劑量(1015ions/cm2,3×1015ions/cm2,1016ions/cm2)對SR材料表面進行離子注入,分別得到三種碳-硅橡膠改性材料(C-SR1、C-SR2及C-SR3)。
　　2.通過掃描電鏡(Scanningelectronmicroscope,SEM)、原子力顯微鏡(AtomicForceMicroscope,AFM)對改性材料表面的微觀形貌進行觀察比較。
　　第二部分:SR及C-SR的表面理化性能

7、檢測
　　采用傅立葉紅外光譜(Fouriertransforminfraredspectrometer,FTIR)、X射線光電子能譜(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)、X射線衍射(X-raydiffraction,XRD)等技術及水接觸角分析檢測并評價純SR、C-SR1、C-SR2及C-SR3材料表面的理化性能,并采用SPSS20.0進行相關的統(tǒng)計學處理。
　　第三部分:材料的細胞相容性

8、評價
　　1.細胞準備:應用體外培養(yǎng)法培養(yǎng)人真皮成纖維細胞,并將細胞接種于各材料表面培養(yǎng),進行后續(xù)實驗。
　　2.實驗分組情況為:
　　1)空白組:普通空白培養(yǎng)板中培養(yǎng)生長的人真皮成纖維細胞;
　　2)SR組:SR材料表面培養(yǎng)生長的人真皮成纖維細胞;
　　3)C-SR1組:C-SR1材料表面培養(yǎng)生長的人真皮成纖維細胞;
　　4)C-SR2組:C-SR2材料表面培養(yǎng)生長的人真皮成纖維細胞;
　　5

9、)C-SR3組:C-SR3材料表面培養(yǎng)生長的人真皮成纖維細胞。
　　3.通過激光共聚焦觀察各組改性材料表面細胞內細胞骨架蛋白(actin)熒光表達情況,并采用CCK-8法檢測人真皮成纖維細胞在各組材料表面的增殖情況,對各組改性材料進行生物安全性評價。
　　4.分別運用免疫熒光技術、Real-timePCR和Westernblot技術檢測分析材料表面培養(yǎng)的人真皮成纖維細胞中細胞粘附相關蛋白OPN、Vinculin、Zyin及T

10、alin的表達情況,對各組改性材料進行生物功能性評價。
　　第四部分:材料細胞相容性提高的機制研究
　　1.采用免疫熒光染色檢測了在加入外源性OPN單克隆抗體或外源性重組OPN蛋白情況下,細胞骨架蛋白(actin)的表達情況,同時比較了各組材料表面細胞生長狀態(tài)及細胞粘附的差異。
　　2.采用WesternBlot技術檢測了材料表面細胞外培養(yǎng)上清中有無OPN的表達及其表達有無差異。
　　3.采用Trans-well

11、趨化試驗檢測了OPN與MMP9是否能促進細胞遷移,并通過明膠酶譜法檢測了各組材料表面細胞內的MMP9活性高低情況。
　　4.在成功構建了MMP9-RNAi模型的基礎上,通過加入與未加入外源性重組OPN,采用激光共聚焦顯微鏡觀察比較OPN與MMP9的表達變化,并觀察細胞的形態(tài)、增殖及粘附變化。
　　研究結果：
　　1.成功制備了SR,并采用多功能離子注入機在預先設定的條件下成功制備了三種不同離子注入條件的C-SR改性材料

12、。
　　2.使用SEM觀察C-SR改性材料與SR比較,微觀形貌無明顯差異。進一步用AFM觀察得到,SR表面呈光滑樣,稍有不平;碳離子注入后,C-SR材料表面呈現丘陵樣地形,“突起”分布隨離子注入劑量的增加而增多,但分布較為均勻。
　　3.FTIR結果顯示,C-SR各組改性材料與SR比較無明顯變化,提示C-SR并未改變SR的有機官能團構成;C-SR的XRD圖譜較SR有所改變,形成了新的峰,提示C離子的注入在SR表面形成了新的晶

13、體結構,但差異并不顯著;XPS分析顯示經過了碳離子注入的C-SR其Si、C、O三種原子的峰均發(fā)生了變化,其中C原子的百分比隨離子注入劑量的增高峰值越高,Si原子的百分比隨離子注入劑量的增高峰值越低,說明碳離子注入后取代了部分Si原子,改變了材料的表面化學成分;通過水接觸角分析得到,C-SR的水接觸角較SR明顯降低,說明碳離子注入可以改善SR材料表面的疏水性。
　　4.采用激光共聚焦顯微鏡觀察各組材料表面培養(yǎng)的細胞內骨架蛋白(act

14、in)的表達情況得出,C-SR表面培養(yǎng)的細胞內actin的熒光表達量明顯較SR強烈,且隨著改性材料C離子注入劑量的增多,其表達量越高。
　　5.CCK-8法檢測材料表面細胞的增殖情況,結果顯示,C-SR表面培養(yǎng)的細胞較SR具有更好的細胞增殖能力,且隨著離子注入劑量的增加,其細胞增殖情況越好。
　　6.對各組材料表面培養(yǎng)的細胞內細胞粘附相關蛋白(OPN、Vinculin、Talin、Zyxin)等進行免疫熒光染色及Wester

15、nBlot檢測結果顯示,C-SR材料表面細胞表達的粘附相關蛋白(OPN、Vinculin、Talin、Zyxin)均優(yōu)于SR,并隨著碳離子注入劑量的增加,蛋白表達量越高。
　　7.Real-timePCR檢測結果顯示:與SR組相比,C-SR1組、C-SR2組和C-SR3組的細胞中Vinculin-mRNA、OPN-mRNA表達明顯增高(P<0.05),且在C-SR三組中比較,隨著離子注入劑量的增加,VinculinmRNA、OPN

16、mRNA表達呈現遞增趨勢。
　　8.在對OPN的作用研究中,我們加入外源性OPN單克隆抗體后,可觀察各組材料細胞內骨架蛋白的表達水平均有所下降,且細胞的形態(tài)、粘附情況也受到影響,而在加入外源性重組OPN蛋白后可逆轉這一現象。
　　9.采用WesternBlot檢測到各組材料表面細胞外均有OPN的分泌,OPN可能在細胞外起橋梁蛋白作用,能夠調節(jié)相關蛋白酶的表達,從而促進細胞的粘附、增殖與遷移。
　　10.采用Trans-

17、well趨化試驗檢測了OPN與MMP9的遷移能力,觀察到OPN與MMP9均具有促進細胞遷移的作用;進一步在明膠酶譜試驗中得到在C-SR材料上MMP9活性明顯高于SR。
　　11.成功構建了MMP9-RNAi模型,并在此基礎上比較了加入與未加入外源性重組OPN蛋白情況下,觀察到未加入外源性重組OPN蛋白時,MMP9與OPN的表達水平均有所下降,細胞的粘附、生長狀態(tài)、增殖情況也較差,在加入了外源性重組OPN后,上述情況明顯有所改善。表

18、明,外源性OPN能上調MMP9表達,兩者共同參與了改性材料細胞相容性的提高。
　　結論:
　　1.C-SR改性材料制作方法較為簡便,具有可加工性,可行性較好。
　　2.C-SR改性材料表面理化性能穩(wěn)定,既保持了SR的優(yōu)良特性,又改善了SR的疏水性能,使其具有更好的組織親和力。
　　3.C-SR改性材料表面培養(yǎng)的人真皮成纖維細胞生長狀態(tài)、增殖能力、細胞粘附能力均優(yōu)于SR,說明C-SR較SR具有更好的細胞相容性,更適