過氧亞硝酸根對蛋白質中酪氨酸硝化作用及其機理研究.pdf

1、過氧亞硝酸根(peroxynitrite,ONOO-)是生物體內由一氧化氮(nitric oxide,NO·)和超氧根陰離子(superoxide,O2-·)快速結合生成的一種生物活性小分子。它具有強氧化和硝化能力,可以造成DNA、蛋白質和脂質等生物大分子的修飾與損傷,其中ONOO-介導的蛋白質酪氨酸殘基硝化可能在心血管疾病、神經退行性疾病和炎癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用。蛋白質酪氨酸硝化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾作用,它可

2、以使蛋白質改性,使酶失活或激活,并產生一系列的細胞毒性作用,包括影響細胞信號傳導通路,引起細胞能量耗竭,導致細胞的凋亡、死亡,最終可能引發(fā)疾病。但是,目前有關ONOO-誘導蛋白質酪氨酸硝化的機制、硝化的位點及位點選擇性等問題尚不明確。本論文從實驗和理論兩方面研究ONOO-介導的酪氨酸硝化及其反應機理,并以胰島素和p16(INK4a)蛋白為對象,通過體外實驗方法,研究ONOO-誘導蛋白質酪氨酸硝化的過程、選擇位點以及硝化過程中蛋白質二級結

3、構的變化。 論文首先研究ONOO-對酪氨酸的硝化作用及其反應機理。氨基酸是蛋白質的物質組成,ONOO-對蛋白質的損傷主要通過其對側鏈殘基的修飾表現(xiàn)出來,因此研究ONOO-對酪氨酸硝化是探討ONOO-對蛋白質酪氨酸殘基硝化作用的基礎。 采用量子化學計算中的密度泛函方法,從協(xié)同反應與自由基反應兩條途徑,對ONOO-與酪氨酸的反應機理進行研究。ONOO-可以在堿性條件下穩(wěn)定存在,但在生理pH條件下,它會部分質子化為過氧亞硝酸(

4、peroxynitrous acid,ONOOH,pKa=6.8),ONOO-與ONOOH可共存于溶液體系中。在B3LYP/6-311 G(d,p)計算水平上對該反應體系中的反應物、中間體、過渡態(tài)和產物進行幾何構型優(yōu)化,計算振動頻率和能量。計算結果表明,ONOOH不易與酪氨酸直接反應生成3-硝基酪氨酸(3-NT),其所需能量高于ONOOH分解所需能量；ONOOH分解產生自由基·OH和NO2·后,可再與酪氨酸分步作用,主反應路徑為·OH先

5、進攻酪氨酸酚羥基H原子,生成中間體酪氨酸自由基,NO2·再與酪氨酸自由基經無勢壘結合生成穩(wěn)定的中間體,隨后異構化為產物3-NT。在理論研究的基礎上,采用高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜(HPLC-ESI-ITMS)方法對ONOO-與酪氨酸的反應產物進行分離、鑒定；通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和核磁共振譜(1HNMR)等分析方法對收集到的主產物進行表征；采用紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)考察反應物濃度和pH等因素對酪氨酸硝化的影響

6、。 結果顯示,ONOO-與酪氨酸反應可得到兩種產物,其中主產物為3-NT,次產物為羥基酪氨酸,這與理論研究結果一致。 其次,通過體外實驗模擬體內環(huán)境,將ONOO-以恒定速率持續(xù)注入到蛋白質溶液中,并保持反應體系維持在生理pH條件。采用UV-Vis、HPLC-ESI-ITMS和衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)等分析方法對ONOO-誘導胰島素酪氨酸殘基的硝化過程、硝化位點以及胰島素二級結構的變化進行研究。結

7、果表明,生理pH條件下,ONOO-可誘導胰島素酪氨酸硝化生成3-NT,隨著胰島素暴露于ONOO-中時間的延長,硝化產物的含量也不斷增加。胰島素分子的4個酪氨酸殘基中,最多有3個可被ONOO-硝化,胰島素硝化的混合產物中包含單、雙和三硝化的胰島素,但以單硝化胰島素為主產物。對胰島素A、B鏈進行拆分和酶解,通過肽譜分析和多肽序列測定方法確定胰島素被硝化的3個酪氨酸殘基分別是Tyr-A19、Try-B16與Tyr-B26,其中Yyr-A19是

8、優(yōu)先硝化位點,其次是Tyr-B26,最后為Tyr-B16,對于Tyr-A14卻未觀察到其硝化產物存在。酪氨酸殘基硝化后,胰島素分子的部分折疊結構被打開,蛋白質分子原有的α-螺旋主體結構向隨意卷曲結構轉變,其中α-螺旋結構含量由原來的41.7％降至19.1％,隨意卷曲結構含量由原來的13.7％增至35.3％。最后,采用UV-Vis和HPLC-ESI-ITMS/MS等分析手段,研究ONOO-誘導p16蛋白的硝化過程及硝化位點。結果表明,生理

9、條件下ONOO-可誘導p16蛋白酪氨酸殘基硝化生成3-NT,隨著p16蛋白暴露于ONOO-中時間的延長,p16蛋白硝化產物也不斷增加。P16蛋白的兩個酪氨酸殘基均可被ONOO-硝化,反應混合物中包含單、雙硝化產物,其中單硝化p16蛋白為主產物。通過肽譜分析和多肽序列測定方法,確定Tyr44為優(yōu)先硝化位點,隨著反應時間的延長,p16蛋白分子中的另一個酪氨酸殘基Tyr-129也可被ONOO-硝化。 本論文通過理論和實驗方法對ONOO