蛋白質(zhì)-血紅素復(fù)合物過氧化物酶活性及其催化蛋白質(zhì)氧化和酪氨酸硝化作用研究.pdf

1、血紅素（Fe-protoporphyrin IX，heme）是一種自然界廣泛存在的蛋白質(zhì)輔基，在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。在某些病理狀態(tài)下發(fā)生嚴(yán)重溶血時(shí)，血紅素從血紅蛋白中釋放出來后可能結(jié)合其他蛋白及生物大分子。不同蛋白質(zhì)采用不同方式結(jié)合血紅素并對其過氧化物酶活性產(chǎn)生不同的影響。血紅素能催化脂質(zhì)過氧化，增加周圍蛋白質(zhì)以及DNA氧化損傷。在H2O2和亞硝酸鹽的存在下，血紅素能催化酪氨酸硝化，該途徑被認(rèn)為是體內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸硝化的主要途徑之一。

2、蛋白質(zhì)酪氨酸硝化作為機(jī)體在氮氧化物存在下蛋白質(zhì)氧化損傷的特殊形式，與神經(jīng)退行性疾病、2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitus，T2Dm）及心血管疾病等多種疾病有關(guān)。除此之外，蛋白質(zhì)羰基化作為一種不可逆的蛋白質(zhì)氧化，同樣也是heme-H2O2-NO2-體系中不可避免的氧化損傷。因此，蛋白質(zhì)結(jié)合血紅素后對其過氧化物酶活性的影響直接關(guān)系到結(jié)合的復(fù)合物對周邊蛋白的氧化損傷情況。本文研究了以下三種血紅素復(fù)合物的過氧化物酶活性及其

3、對周邊蛋白質(zhì)的損傷：
　?。?）胰島素與血紅素的結(jié)合特性及對其過氧化物酶活性的影響。研究了胰島素與血紅素的結(jié)合特性以及heme-insulin復(fù)合物的過氧化物酶活性。結(jié)果顯示胰島素能與血紅素結(jié)合并且能夠增加其過氧化物酶活性。Heme-insulin復(fù)合物催化H2O2-NO2-體系硝化蛋白質(zhì)酪氨酸的能力強(qiáng)于游離的血紅素，這可能與β細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)硝化增加有關(guān)。除此之外，在過氧化氫的作用下，胰島素自身的酪氨酸也被氧化生成雙酪氨酸，導(dǎo)致胰島

4、素分子間產(chǎn)生酪氨酸自由基交聯(lián)，并且這種共價(jià)鍵交聯(lián)已被證實(shí)會影響胰島素的生物活性。無論是硝化應(yīng)激升高還是胰島素的生理功能缺失都與T2Dm的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)。因此，這些研究揭示了heme-insulin在體內(nèi)可能存在的生理功能，即在T2Dm的發(fā)病過程中可能具有潛在的推進(jìn)作用。
　　（2）HSA-heme復(fù)合物的過氧化物酶活性及其功能研究。研究人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）-heme復(fù)合物的過氧化物酶活性

5、及其功能。結(jié)果顯示HSA結(jié)合血紅素不僅沒有減弱反而增加了H2O2與血紅素的親和力。HSA-heme催化酪氨酸氧化和硝化的能力也明顯強(qiáng)于游離的血紅素。高鐵白蛋白不僅能催化自身酪氨酸硝化，還促進(jìn)了共溫浴蛋白—烯醇酶的硝化，但與游離的血紅素相比卻能起到減弱烯醇酶羰基化的作用。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)與H2O2作用后血紅素與HSA產(chǎn)生共價(jià)鍵交聯(lián)，表明HSA捕獲了隨著ferryl heme同時(shí)產(chǎn)生的自由基并形成了蛋白質(zhì)自由基。利用碘化法修飾HSA中的酪氨酸

6、后，HSA失去了減弱共溫浴蛋白羰基化的作用，反而促進(jìn)了共溫浴蛋白的硝化和羰基化以及自身的羰基化。此外，低濃度的谷胱甘肽能有效地抑制HSA-heme催化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)硝化，但對羰基化沒有明顯作用。這些結(jié)果表明，HSA通過其酪氨酸殘基清除血紅素催化過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基，從而避免蛋白質(zhì)遭受不可逆的氧化損傷，同時(shí)內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽能有效地將酪氨酰自由基還原為酪氨酸避免了酪氨酸硝化可能帶來的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的變化。
　?。?）甘油醛-

7、3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）與血紅素相互作用及其功能的研究。將GAPDH-heme與HSA-heme進(jìn)行比較，研究其過氧化物酶活性以及在H2O2-NO2-體系中對周圍蛋白質(zhì)的影響作用。結(jié)果顯示GAPDH能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的血紅素降解，并且與HSA的效果相當(dāng)。GAPDH-heme的過氧化物酶活性強(qiáng)于游離的血紅素，但明顯低于HSA-heme。比較催化氧化酪氨

8、酸及硝化蛋白質(zhì)酪氨酸的能力結(jié)果為：HSA-heme>heme>GAPDH-heme，這表明GAPDH-heme對催化底物有一定的選擇性，并且降低了血紅素導(dǎo)致的硝化應(yīng)激。GAPDH同樣也能降低血紅素-H2O2-NO2-體系誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化，但GAPDH自身羰基化增加并且發(fā)生蛋白質(zhì)降解。此外，GAPDH比HSA能夠更好地抑制heme-GO-NO2-體系對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用。利用HPLC檢測在H2O2作用下GAPDH與血紅素沒有發(fā)