人乳腺腫瘤酪氨酸磷酸化差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景及目的:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,目前其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢。而乳腺癌是一種全身性的疾病,單純的手術(shù)治療不能顯著提高其生存率。為了提高其治愈率,乳腺癌的綜合治療顯得非常重要。近年來,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了HER-2基因在20％～30％的乳腺癌中存在明顯擴增和過表達,并針對性的研究出來了赫賽汀(herceptin)這種藥物臨床應(yīng)用取得了很好的效果。
　　 乳腺癌其發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因及多途徑改變的復(fù)雜過

2、程,其癌變機制仍不是十分明確。本實驗從酪氨酸磷酸化修飾入手,研究乳腺腫瘤蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的表達差異。為研究乳腺癌發(fā)生,發(fā)展,治療,檢測及防治研究開辟新的思路。
　　 方法:本實驗收集了20例乳腺癌惡性腫瘤和12例乳腺癌良性腫瘤的新鮮標(biāo)本,采用酪氨酸磷酸化免疫富集的方法收集多肽,并用LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀進行鑒定分析,對可能有意義的差異表達酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)采用免疫印跡技術(shù)加以驗證。并在四例乳腺癌細胞株進行培養(yǎng),收集培養(yǎng)

3、后的乳腺癌細胞進行差異酪氨酸磷酸化蛋白研究,比較人乳腺癌和癌株在酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達的差異,為乳腺癌的進一步研究提供模型。
　　 結(jié)果:本實驗對人乳腺腫瘤的研究中共找到了772種酪氨酸磷酸化差異性蛋白質(zhì),其中在惡性腫瘤中有581種磷酸化差異蛋白上調(diào),良性腫瘤中有191種酪氨酸磷酸化蛋白上調(diào)。根據(jù)P＜0.05,良惡性腫瘤中鑒別出來了116種酪氨酸磷酸化差異蛋白質(zhì)。另外在惡性腫瘤中根據(jù)P＜0.05中的P數(shù)值由低到高排列出來了51種

4、差異化酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)了PKCD、CDCP1、AXL在人乳腺癌中表達上調(diào)。IGF1R在人乳腺纖維瘤中表達上調(diào)。并應(yīng)用免疫印跡法驗證(WesternBlotting)PKCD、CDCP1酪氨酸磷酸化等蛋白質(zhì)。我們還選擇了Cal-85-1、hcc-1599、du-4475、MCF-7等四株乳腺癌細胞株進行培養(yǎng),收獲乳腺癌細胞進行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究。發(fā)現(xiàn)了Cal-85-1、hcc-1599、du-4475這三株乳腺癌株中PKCD、C

5、DCP1表達上調(diào),而MCF-7乳腺癌株中PKCD、CDCP1未見明顯表達。并通過免疫印跡法(Western Blotting)對PKCD、CDCP1等加以驗證。
　　 結(jié)論:1.收集了乳腺癌及乳腺纖維瘤組織,并培養(yǎng)了乳腺癌細胞株,裂解并富集了酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì),為今后的乳腺癌酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的進一步研究打下基礎(chǔ)。
　　 2.本次試驗首次應(yīng)用酪氨酸磷酸化免疫沉淀的方法富集了乳腺腫瘤及細胞株的酪氨酸磷酸化蛋白,初步探索

6、了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和治療,及預(yù)后檢測的分子機制,為乳腺癌的診斷提供了新的腫瘤標(biāo)志物。本實驗避免了以往磷酸化蛋白質(zhì)研究及腫瘤發(fā)病機制,進程及治療等領(lǐng)域研究針對個別蛋白質(zhì)的局限性。首次把酪氨酸磷酸化定量蛋白應(yīng)用于乳腺癌發(fā)病機制及治療的研究。克服了普通雙向凝膠電泳重復(fù)性差,動態(tài)范圍小的缺點。并且建立新的定量比較蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)路線,并掌握了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本方法。
　　 3.篩選了多個乳腺腫瘤差異性磷酸化蛋白質(zhì),其中PKCD、CDC

7、P1、AXL、IGF1R等在乳腺癌細胞中參與了各項生理過程,其中的一些為乳腺癌的個體化治療提供潛在靶向藥物,另一些能夠作為腫瘤標(biāo)志物對乳腺癌疾病的診斷和術(shù)后檢測提供信息。
　　 4.在Cal-85-1、Hcc-1599、Du-4475等細胞株中發(fā)現(xiàn)了與乳腺癌中表達量上調(diào)一致的PKCD、CDCP1等酪氨酸磷酸化差異蛋白質(zhì),這些細胞株能夠為研究未來這些蛋白質(zhì)功能和新藥研發(fā)提供模型。本實驗研究為未來乳腺癌的研究打下了堅實的基礎(chǔ)。