玉米紋枯病菌自激活轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)篩選.pdf

1、玉米紋枯病是危害嚴(yán)重的玉米病害，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）是玉米紋枯病的病原菌，其較強(qiáng)的致病及存活能力使玉米紋枯病的防治成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一大難題?；虻谋磉_(dá)調(diào)控在生物體中具有至關(guān)重要的作用，而轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)過(guò)程中最關(guān)鍵的一步，所以探索立枯絲核菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)于防治玉米紋枯病具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率，增強(qiáng)或抑制基因的表達(dá)，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要組成部分。在立枯絲核菌等病原真菌侵染

2、寄主時(shí)，大量的轉(zhuǎn)錄因子參與到增強(qiáng)致病力、破壞寄主防御系統(tǒng)等過(guò)程中。所以，對(duì)立枯絲核菌轉(zhuǎn)錄因子的研究，能夠更加深入的了解立枯絲核菌在生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力和侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，不僅為后續(xù)的研究提供有益參考，而且在農(nóng)業(yè)病害防治領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　本文著重于立枯絲核菌轉(zhuǎn)錄因子的研究，通過(guò)建立立枯絲核菌cDNA文庫(kù)，利用酵母雙雜交自激活現(xiàn)象篩選到71個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活功能的自激活cDNA序列，并鑒定其中41條為轉(zhuǎn)錄因子。此方法

3、結(jié)合了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)庫(kù)分析，高效、準(zhǔn)確地驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能，對(duì)于闡明玉米紋枯病的生長(zhǎng)周期具有重要的意義。將這71條自激活序列在NCBI的Blastx中進(jìn)行比對(duì)，找到每條序列所編碼的蛋白，其中能找到同源蛋白的有55條，占全部序列的77.5％;未找到確切同源蛋白的16條，占22.5％。運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的方法，將這71條自激活序列放入真菌轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，其中41條能匹配到轉(zhuǎn)錄因子序列，其余30條序列未能得到匹配。這些鑒定到的

4、轉(zhuǎn)錄因子分別來(lái)自13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，包括Zn2Cys6、Winged helixrepressor DNA-binding、HMG等，在生長(zhǎng)代謝，抗藥性，侵染寄主等方面發(fā)揮重要作用。至于未鑒定到的轉(zhuǎn)錄因子，因?yàn)槲覀円呀?jīng)用自激活實(shí)驗(yàn)的方法證明了這71個(gè)蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能，而且轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)資源并非是最新的，有很多新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子未在數(shù)據(jù)庫(kù)中得到說(shuō)明和歸類，所以可以初步判斷這30條序列是潛在的、新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子。最后將所有71條序列放

5、入SMART數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，41個(gè)已鑒定的轉(zhuǎn)錄因子都能檢測(cè)到確定的結(jié)構(gòu)域，其中大部分是常見的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域;而未鑒定到的30個(gè)新轉(zhuǎn)錄因子中有10個(gè)未檢測(cè)到確定的結(jié)構(gòu)域，這有可能是導(dǎo)致部分序列未在轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中得到鑒定的原因。所以，數(shù)據(jù)庫(kù)中的空白更好的說(shuō)明本試驗(yàn)所采用的文庫(kù)自激活篩選方法不僅可以在立枯絲核菌cDNA文庫(kù)中準(zhǔn)確地驗(yàn)證已知的轉(zhuǎn)錄因子，還能篩選到新的、潛在的轉(zhuǎn)錄因子，這對(duì)于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控研究和對(duì)立枯絲核菌生長(zhǎng)代