玉米大斑病菌轉(zhuǎn)錄因子StSte12的亞細(xì)胞定位、靶基因篩選及其表達(dá)規(guī)律分析.pdf

1、本課題組在前期研究中克隆了玉米大斑病菌Fus3/Kss1-homolog MAPK級(jí)聯(lián)途徑下游核心轉(zhuǎn)錄因子StSte12的基因，并獲得了3株不同沉默程度的RNAi轉(zhuǎn)化子，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子的分析發(fā)現(xiàn)，該基因參與調(diào)控病菌的致病過(guò)程，但其具體的調(diào)控的機(jī)制尚不清晰。本研究利用基因敲除及過(guò)表達(dá)技術(shù)獲得了StSTE12基因敲除及過(guò)表達(dá)突變體，通過(guò)對(duì)突變體的分析，明確了該轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位;利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定了可能受StSte12調(diào)控的幾丁質(zhì)合酶基

2、因家族，并利用Real-time PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)基因可能受該轉(zhuǎn)錄因子的正調(diào)控;利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)確定了StSte12作用的靶基因，并明確了在該基因的結(jié)合位點(diǎn)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，將StSTE12基因過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌野生型菌株01-23，通過(guò)草胺磷抗性篩選、GFP熒光檢測(cè)、特異引物PCR及Real-time PCR驗(yàn)證，獲得了2株StSTE12基因過(guò)表達(dá)突變體。

3、>　　2.以pBS-pUC質(zhì)粒為基本骨架，構(gòu)建了玉米大斑病菌StSTE12基因敲除載體，通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化野生型菌株01-23，通過(guò)潮霉素B抗性篩選、特異引物PCR及RT-PCR驗(yàn)證，篩選得到了2株StSTE12基因敲除突變體。
　　3.通過(guò)對(duì)StSTE12基因過(guò)表達(dá)突變體細(xì)胞內(nèi)GFP熒光觀察，并結(jié)合DAPI染色方法，確定了StSte12亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中。
　　4.利用生物信息學(xué)方法，在玉米大斑病菌基因

4、組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出幾丁質(zhì)合酶基因家族，該家族包含8個(gè)與幾丁質(zhì)合成相關(guān)的基因StCHS1-StCHS8;利用Real-time PCR技術(shù)分析了這8個(gè)基因在野生型菌株、StSTE12基因敲除及過(guò)表達(dá)突變體菌株中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比突變體中StCHS3、StCHS5、StCHS7基因的表達(dá)量均表現(xiàn)出顯著差異，并且在StSTE12基因的敲除突變體中表達(dá)量顯著降低，在過(guò)表達(dá)突變體中顯著升高，表明這3個(gè)幾丁質(zhì)合酶基因很可能受StS