ABI5家族轉(zhuǎn)錄因子在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活機(jī)理的研究.pdf

1、擬南芥ABI5是一個(gè)響應(yīng)ABA信號(hào)的堿性亮氨酸拉鏈類轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受ABA和各種生物、非生物脅迫的誘導(dǎo)。ABl5可與順式元件ABRE相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游大量抗旱、耐鹽堿等相關(guān)功能基因的表達(dá)，影響著如植物抗逆性、種子成熟和萌發(fā)等過(guò)程。
　　本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)擬南芥ABI5家族（AtDPBFs/ABFs）的9個(gè)成員進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有7個(gè)保守的區(qū)域。在酵母單雜交系統(tǒng)中對(duì)ABI5進(jìn)行N端/C端雙向缺失突變分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，ABI5中存在

2、著兩個(gè)可以激活報(bào)告基因的區(qū)域，一個(gè)是位于羧基端的非保守的區(qū)域，另一個(gè)就是保守區(qū)Ⅱ（CRII）。CRII是否在植物細(xì)胞中也同樣具有轉(zhuǎn)錄激活活性？ABI5在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮怎樣的功能？ABI5的這些功能又是通過(guò)和哪些分子相互作用構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)相互交叉的多樣功能與信號(hào)網(wǎng)絡(luò)？該轉(zhuǎn)錄因子在植物干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮怎樣的功能？為回答這一系列問(wèn)題，本研究針對(duì)ABI5家族轉(zhuǎn)錄因子在植物細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄機(jī)理進(jìn)行了深入研究。
　　本論文的主要研究結(jié)

3、果如下：
　?。?）利用pull-down技術(shù)初步篩選與ABI5相互作用的蛋白：首先將含有pET32a-ABI5載體的大腸桿菌BL21 Star（DE3）進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Ni-NTA親和層析純化，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定純化后，隨后用His Pull-down技術(shù)分離擬南芥ABI5轉(zhuǎn)錄因子相互作用蛋白質(zhì)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間未出現(xiàn)差異條帶。原因可能是轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄機(jī)器中的某個(gè)或某些蛋白因子的相互作用發(fā)生在一瞬間

4、，如何捕捉到這一短暫過(guò)程，仍需要進(jìn)行更多的嘗試。
　?。?）利用擬南芥葉肉原生質(zhì)體瞬間表達(dá)系統(tǒng)在植物細(xì)胞中分析CRII的轉(zhuǎn)錄激活活性。該部分實(shí)驗(yàn)是利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的瞬間表達(dá)載體（報(bào)告基因載體和效應(yīng)載體），通過(guò)酶解法分離擬南芥葉肉原生質(zhì)體，PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞后對(duì)其進(jìn)行GUS活性分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，CRII在植物細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄激活活性，這與先前在酵母細(xì)胞中得到的結(jié)果一致。另外，該實(shí)驗(yàn)中六聚組（報(bào)告基因載體含有6個(gè)重復(fù)的Gal4

5、結(jié)合位點(diǎn)）相對(duì)于三聚組（報(bào)告基因載體含有3個(gè)重復(fù)的Gal4結(jié)合位點(diǎn)），其GUS活性增加了23％。正如我們所期待的，在報(bào)告基因中增加Gal4結(jié)合位點(diǎn)UASGal1的重復(fù)序列可以提高下游報(bào)告基因的表達(dá)，但是這種活性升高趨勢(shì)并不與UASGal1的重復(fù)數(shù)量呈線性關(guān)系。
　?。?）擬南芥ABI5轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫中的作用研究。檢測(cè)ABI5處于活性狀態(tài)時(shí)的作用，尤其是在植物抵抗干旱逆境的作用。本研究缺失了ABI5轉(zhuǎn)錄激活抑制區(qū)域以及泛素化