NGF殼聚糖微球—高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備及其促神經(jīng)損傷修復(fù)的研究.pdf

1、周圍神經(jīng)缺損是臨床最常見的創(chuàng)傷之一。直接縫合和自體神經(jīng)移植是治療該疾病最常用的兩種方法，然而，這兩種治療方法均存在一定的局限性。近年來，神經(jīng)組織工程學(xué)的迅速發(fā)展為臨床治療神經(jīng)缺損帶來新的希望。多種以天然或人工合成多聚物為主要原料的中空神經(jīng)支架，如NeurotubeTMPGA和NeuraGenTMCollagen等，已經(jīng)獲得美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）認(rèn)證，可在臨床應(yīng)用。然而，這些中空神經(jīng)支架對(duì)長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損的修復(fù)效果并不理想。分析原因

2、后，我們認(rèn)為中空神經(jīng)支架缺乏有效的仿生微結(jié)構(gòu)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能。
　　大量基礎(chǔ)研究表明：神經(jīng)支架內(nèi)部的微管樣結(jié)構(gòu)可有效引導(dǎo)雪旺細(xì)胞線形排列，對(duì)引導(dǎo)再生神經(jīng)定向生長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用。本課題組前期制備了一種新型膠原-殼聚糖高仿生神經(jīng)支架（CCH），該支架具有軸向平行排列的微管樣結(jié)構(gòu)，與正常神經(jīng)的基底膜結(jié)構(gòu)相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CCH仿生支架可引導(dǎo)再生神經(jīng)定向生長(zhǎng)。然而，CCH仿生支架還缺乏有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能，這是促進(jìn)神經(jīng)再生的另一個(gè)重要因素。因

3、此，應(yīng)用CCH仿生支架聯(lián)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有望進(jìn)一步提高神經(jīng)缺損的修復(fù)效果，更好更快的促進(jìn)神經(jīng)再生。目前，營(yíng)養(yǎng)因子復(fù)合神經(jīng)支架最常用的方法是“物理吸附”—將營(yíng)養(yǎng)因子通過微型注射器注入神經(jīng)支架內(nèi)部。盡管“物理吸附”操作簡(jiǎn)單，對(duì)支架的微結(jié)構(gòu)無明顯影響，但是該復(fù)合方法可降低營(yíng)養(yǎng)因子的緩釋性能和生物利用率。因此，尋找一種可提高營(yíng)養(yǎng)因子的緩釋性能、保護(hù)其生物活性的緩釋載體至關(guān)重要。
　　本研究選用殼聚糖為主要原料，應(yīng)用“乳化-離子交聯(lián)”技術(shù)，制

4、備包埋神經(jīng)生長(zhǎng)因子的殼聚糖微球（NGF-CMSs），交聯(lián)劑為三聚磷酸鈉（STPP）。體外緩釋動(dòng)力學(xué)和緩釋生物學(xué)結(jié)果表明：NGF-CMSs可控性緩釋具有生物活性的神經(jīng)生長(zhǎng)因子。隨后，我們?cè)谥苽渚哂形⒐軜咏Y(jié)構(gòu)的CCH仿生支架的基礎(chǔ)上，應(yīng)用“后復(fù)合”技術(shù)將NGF-CMSs復(fù)合于CCH仿生支架，制備NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)（NGF-CMSs/CCH）。NGF-CMSs/CCH具有平行排列的微管樣結(jié)構(gòu)，殼聚糖微球較均勻分布在微管樣結(jié)構(gòu)

5、內(nèi)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NGF-CMSs/CCH可顯著降低神經(jīng)生長(zhǎng)因子的“突釋量”和緩釋率，可控性緩釋具有生物活性的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，提高神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物利用率。應(yīng)用NGF-CMSs/CCH修復(fù)大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該緩釋系統(tǒng)可加快神經(jīng)再生速度，縮短再生神經(jīng)軸突到達(dá)靶肌肉的時(shí)間，促進(jìn)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。整個(gè)研究分為以下兩個(gè)部分：
　　第一部分：NGF-CMSs的制備及其相關(guān)性能的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：制備NGF

6、-CMSs；檢測(cè)NGF-CMSs相關(guān)性能。
　　方法：以殼聚糖為主要原料，應(yīng)用“乳化-離子交聯(lián)”技術(shù)，制備NGF-CMSs；分別使用不同濃度的STPP溶液（1％、3％、5％及10％（w/v））對(duì)殼聚糖微球進(jìn)行交聯(lián)；應(yīng)用傅里葉紅外光譜（FTIR）分析STPP與殼聚糖交聯(lián)情況；應(yīng)用掃描電鏡、粒徑分布、包埋率、載藥率以及體外緩釋動(dòng)力學(xué)對(duì)不同交聯(lián)濃度的NGF-CMSs性能進(jìn)行篩選，并確定最佳交聯(lián)濃度；利用PC12細(xì)胞活力測(cè)定和MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)

7、估NGF-CMSs的緩釋生物學(xué)性能。
　　結(jié)果：掃描電鏡結(jié)果顯示：不同交聯(lián)濃度的NGF-CMSs均具有球形結(jié)構(gòu)，表面相對(duì)粗糙，大小不等，STPP濃度對(duì)微球的表面形態(tài)無明顯影響；傅里葉紅外光譜結(jié)果顯示：殼聚糖的氨基和STPP的磷酸基發(fā)生靜電反應(yīng)，說明STPP與殼聚糖微球交聯(lián)成功；STPP濃度對(duì)NGF-CMSs的平均粒徑、包埋率、載藥率以及緩釋動(dòng)力學(xué)性能均有顯著影響，NGF-CMSs的平均粒徑在20.5～31.2μm之間，且隨著STP

8、P濃度的增加而增大；NGF-CMSs的包埋率在62.8％～87.9％之間，載藥率在1.8％～12.5％之間，這兩者均隨著STPP濃度的增加而減小；NGF-CMSs持續(xù)緩釋NGF達(dá)7天，NGF緩釋率隨著STPP濃度的增加而減少；NGF-CMSs的緩釋液可維持PC12細(xì)胞的生物活性，并誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元表型，表明NGF-CMSs有效緩釋具有生物活性的NGF，提高NGF生物利用率。
　　結(jié)論：經(jīng)過篩選，我們確定3％STPP為最佳交聯(lián)濃度

9、。3％STPP交聯(lián)的NGF-CMSs具有良好的平均粒徑、較高的包埋率和載藥率、可控的緩釋動(dòng)力學(xué)性能以及穩(wěn)定的緩釋生物學(xué)性能，為下一步將其復(fù)合于高仿生神經(jīng)支架，修復(fù)神經(jīng)缺損奠定良好基礎(chǔ)。
　　第二部分：NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備及其修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：制備NGF-CMSs/CCH緩釋系統(tǒng)，探討NGF-CMSs/CCH緩釋系統(tǒng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的效能。
　　方法：應(yīng)用“后復(fù)合”技術(shù)將

10、NGF-CMSs復(fù)合于CCH高仿生支架，制備NGF-CMSs/CCH緩釋系統(tǒng)；應(yīng)用掃描電鏡觀察NGF-CMSs/CCH微結(jié)構(gòu)；應(yīng)用體外緩釋動(dòng)力學(xué)及緩釋生物學(xué)檢測(cè)NGF-CMSs/CCH的緩釋性能；分別將NGF-CMSs/CCH和其他神經(jīng)支架組橋聯(lián)大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損后，應(yīng)用神經(jīng)電生理、熒光金逆行示蹤標(biāo)記以及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)明確再生神經(jīng)的功能恢復(fù)情況，應(yīng)用組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和靶肌肉形態(tài)學(xué)評(píng)估神經(jīng)再生情況。
　　結(jié)果：NGF-CMSs

11、/CCH緩釋系統(tǒng)具有軸向平行排列的微管樣結(jié)構(gòu)，NGF-CMSs較均勻分布在微管樣結(jié)構(gòu)內(nèi)；與單純將NGF物理吸附于CCH支架相比（NGF/CCH組），該緩釋系統(tǒng)能顯著降低NGF的“突釋量”及緩釋率，可控性緩釋具有生物活性的NGF達(dá)12周；NGF-CMSs/CCH組的神經(jīng)再生和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)程度顯著優(yōu)于NGF/CCH組和CCH組。
　　結(jié)論：NGF-CMSs/CCH緩釋系統(tǒng)可加快神經(jīng)再生速度，縮短再生神經(jīng)軸突到達(dá)靶肌肉的時(shí)間，促進(jìn)神經(jīng)