熒光假單胞菌蛋白酶水解牛乳特性及免疫功能研究.pdf

1、為了初步探索熒光假單胞菌蛋白酶(Pseudomonas Fluorescens Protease，PFP)水解牛乳的特性以及水解物的免疫活性，先就PFP對(duì)牛乳中主要蛋白質(zhì)的水解特性進(jìn)行了試驗(yàn)研究，確定了水解的最佳條件，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了牛乳的PFP水解物對(duì)小鼠免疫功能的影響。本試驗(yàn)研究包括以下三個(gè)部分：
　　 1.PFP酶學(xué)性質(zhì)的初步研究：對(duì)PFP的含量、活性、酶的最適溫度及pH值進(jìn)行了研究。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(So

2、dium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)確定了經(jīng)過鹽析、超濾、離子交換層析、疏水層析和凝膠層析后的蛋白酶達(dá)到了電泳純；通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酶的含量；通過偶氮酪蛋白法測(cè)定酶的活性及酶的最佳溫度與pH值。結(jié)果表明：得到的PFP為電泳純蛋白酶；酶的含量為62.37μg/mL；酶的活性為17333U/mL，酶的最佳溫度為40℃，最佳pH值為7.5。
　

3、　 2.PFP水解牛乳蛋白特性的研究：就PFP對(duì)牛乳中主要六種蛋白質(zhì)的水解特性進(jìn)行了試驗(yàn)研究，確定了形成免疫活性肽的最佳條件。PFP水解牛乳中六種蛋白質(zhì)后形成的水解物分別用SDS-PAGE和反相高效液相色譜(Reverse phase-highperformance liquid chromatograph，RP-HPLC)法檢測(cè)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了水解工藝參數(shù)。結(jié)果表明：αs-CN、β-CN、κ-CN均在PFP作用下得以水解，而BS

4、A、α-1a、β-1g三種乳清蛋白均未被水解。以RP-HPLC方法對(duì)PFP水解酪蛋白形成的免疫活性肽的測(cè)定，在通過210nm處檢測(cè)最大吸收峰面積得出最佳水解工藝參數(shù)：水解時(shí)間為3h、水解pH6.5、水解溫度40℃、蛋白酶與底物濃度比為1:200(v/v)。
　　 3.PFP水解脫脂乳粉產(chǎn)物免疫活性的研究：試驗(yàn)研究了脫脂乳粉的PFP水解物對(duì)小鼠免疫功能的影響。受試小鼠分別灌喂生理鹽水、低劑量(100mg/Kg.bw)及高劑量(25

5、0mg/Kg.bw)PFP水解脫脂乳粉形成的水解產(chǎn)物，30d后測(cè)定小鼠免疫活性指標(biāo)，就水解物對(duì)小鼠免疫功能的影響進(jìn)行了試驗(yàn)研究。結(jié)果顯示：高、低劑量飼喂對(duì)小鼠生長(zhǎng)均無顯著影響；低劑量飼喂可增強(qiáng)脾臟指數(shù)(P<0.05)，而對(duì)胸腺指數(shù)影響不明顯；高劑量飼喂可增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能(P<0.05)；低劑量飼喂24h及高劑量飼喂48h均顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(P<0.05)，而低劑量飼喂48h及高劑量飼喂24h小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及抗體細(xì)胞

6、生成能力均有極顯著的增強(qiáng)作用(P<0.01)；表明脫脂乳粉的PFP水解物可以提高小鼠免疫功能。
　　 通過完成三個(gè)部分的試驗(yàn)研究，可以得出PFP是一種對(duì)熱有一定的耐受性的蛋白酶，該蛋白酶可水解牛乳中的酪蛋白，但不水解乳清蛋白，且水解物均含有免疫活性肽。PFP對(duì)酪蛋白酶解形成免疫活性肽的水解時(shí)間為3h、水解PH6.5、水解溫度40℃，酶與底物濃度比為1:200(v/v)；PFP水解脫脂乳粉物可以促進(jìn)小鼠免疫器官的發(fā)育、刺激吞噬細(xì)胞