嗜水氣單胞菌金屬蛋白酶克隆表達(dá)及致病特性分析.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種革蘭陰性桿菌，常分布于淡水、土壤、污水及水產(chǎn)動物中，是人、畜和水生動物共患的條件致病菌，能引起水產(chǎn)動物出血性敗血癥，嚴(yán)重危害著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。
　　金屬蛋白酶(metalloproteases)為一種細(xì)菌所分泌的胞外產(chǎn)物，屬于一種蛋白酶類，其在一級結(jié)構(gòu)上差異很大，但其活性中心較為保守、常含有金屬離子（如鋅、鈷、鎳等），其中以鋅離子居多，且是一種依靠金屬離子催化肽鍵水解的蛋

2、白水解酶。大多數(shù)有毒力的金屬蛋白酶都是以Zn2+為催化中心的。
　　根據(jù)已發(fā)表的嗜水氣單胞菌金屬蛋白酶相關(guān)基因序列設(shè)計引物，以嗜水氣單胞菌A.hydrophilaJ-1株基因組為模板，用PCR方法擴(kuò)增得到了金屬蛋白酶基因，并將其命名為ahMP。測序分析后發(fā)現(xiàn)，ahMP全長1281bp，包含一個可編碼嗜水氣單胞菌金屬蛋白酶的完整ORF，大小為1266bp，可編碼421個氨基酸，其中41個堿性氨基酸，51個酸性氨基酸，129個疏水性氨

3、基酸，134個極性氨基酸。同源性分析后發(fā)現(xiàn)，與嗜水氣單胞菌ATCC7966同源性為98％，與嗜水氣單胞菌SSU和水族箱氣單胞菌（Aeromonasaquariorum）AAK1同源性均為97％。ahMP基因含有金屬蛋白酶的zinc活性位點(diǎn)共有序列，功能區(qū)位于151-161氨基酸;功能區(qū)氨基酸序列為:HEXXHNMGLNH，其中X為任意氨基酸，Glu（谷氨酸）具有活性催化作用，并屬于ZnMcSuperfamily（鋅離子依賴的一類金屬蛋白

4、酶家族）。對155株氣單胞菌檢測發(fā)現(xiàn)，ahMP基因陽性率為21.94％;在嗜水氣單胞菌中的分布率高達(dá)87.88％(29/33)，說明ahMP基因在嗜水氣單胞菌中廣泛存在。
　　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增ahMP基因全長，然后將其與載體質(zhì)粒pET-32a(+)連接，成功構(gòu)建出高效重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ahMP。再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)載體BL21(DE3)，經(jīng)雙酶切鑒定后成功進(jìn)行了蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，此重組蛋白以包涵體形式表達(dá)

5、，蛋白大小為64kD。對復(fù)性后的純化重組蛋白進(jìn)行特性分析，此蛋白酶在42-56℃具有較高酶活性，且在50℃具有最大酶活性，而抑制劑1，10-菲咯啉、EDTA、SDS均能抑制其活性，使其酶活減少50％以上，而蛋白酶抑制劑PMSF對其活性沒有明顯抑制作用。Cu2+、Ca2+、Fe2+和Mg2+對其活性沒有明顯的抑制作用，而Zn2+抑制作用較為明顯。上述結(jié)果說明本試驗(yàn)所得到的重組蛋白為一種具有熱穩(wěn)定性，且以鋅離子為活性依賴中心的金屬蛋白酶。<

6、br>　　采用重組金屬蛋白酶對ICR小鼠和鯽魚進(jìn)行致病性試驗(yàn)。該蛋白酶對小鼠沒有致死作用，但能使鯽魚致死，并發(fā)現(xiàn)接種小鼠和鯽魚的臟器都存在一定的病理損傷，主要表現(xiàn)為出血和壞死損傷，尤以腎臟最為嚴(yán)重。血液學(xué)指標(biāo)檢測顯示，能引起機(jī)體白細(xì)胞數(shù)的下降，也對上皮細(xì)胞(EPC)具有細(xì)胞毒性?？傊?，該金屬蛋白酶能降低機(jī)體白細(xì)胞數(shù)從而降低免疫力，同時對上皮細(xì)胞造成損傷，使細(xì)菌更容易入侵機(jī)體，并對機(jī)體能造成直接損傷。本研究為了解嗜水氣單胞菌致病機(jī)理奠定了