陸地棉雄蕊耐熱性及耐熱相關(guān)基因克隆與功能研究.pdf

1、高溫逆境是棉花生殖生長的主要限制因子之一。棉花有性生殖過程對高溫極為敏感。在花蕾發(fā)育及開花過程中，高溫往往導(dǎo)致棉花雄蕊發(fā)育遲緩、形態(tài)畸形、花粉敗育或育性下降，影響有性生殖和受精過程，蕾鈴脫落率升高，造成產(chǎn)量降低。隨著全球氣溫升高，短時高溫天氣頻繁發(fā)生。特別是在中國長江流域，每年夏季日最高溫度超過35℃以上的高溫天氣頻繁發(fā)生，此階段正是棉花開花、結(jié)鈴的盛期，高溫常導(dǎo)致棉花產(chǎn)量與品質(zhì)降低。篩選和培育耐高溫的陸地棉品種對于棉花生產(chǎn)極為迫切。目

2、前國內(nèi)外對陸地棉耐高溫的篩選主要集中在葉片細(xì)胞膜穩(wěn)定性、滲透調(diào)節(jié)物、抗氧化系統(tǒng)代謝物和光合系統(tǒng)等方面，篩選參數(shù)多而不統(tǒng)一，且這些篩選參數(shù)只是陸地棉某一代謝物特性的體現(xiàn)。棉花蕾的發(fā)育及授粉受精過程中耐高溫研究尚少見報(bào)道。開展陸地棉生殖系統(tǒng)的耐熱性研究對于棉花生產(chǎn)具有重要意義。本文目的是利用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉并測定萌發(fā)率，研究蕾發(fā)育過程中溫度逆境對花粉萌發(fā)的影響，建立棉花蕾發(fā)育過程中雄蕊及花粉耐高溫篩選技術(shù)體系，揭示棉花花粉耐高溫機(jī)理，克隆

3、棉花耐高溫相關(guān)的HSP基因并分析其功能。
　　根據(jù)本課題組對220份陸地棉品種花粉耐熱性鑒定的結(jié)果，本研究選出9650短果枝、蘇棉12號、鹽抗1107等耐高溫陸地棉品種及蘇棉16號感高溫陸地棉品種作為研究材料，研究了蕾發(fā)育過程中的高溫和不同培養(yǎng)溫度對花粉萌發(fā)率的影響、耐高溫與感高溫陸地棉品種花粉萌發(fā)率的雜種優(yōu)勢、陸地棉雄蕊中熱激蛋白基因克隆及表達(dá)特性，建立了陸地棉雄蕊耐熱性篩選方法，為探索耐熱機(jī)理和選育耐熱品種提供了理論基礎(chǔ)。主要

4、研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.陸地棉花粉耐高溫研究
　　連續(xù)28天測定4個品種花鈴期的花粉粒在培養(yǎng)溫度30℃、33℃、35℃、37℃和39℃下的萌發(fā)率，分析了高溫前期、高溫期和高溫后期的花粉萌發(fā)率變化規(guī)律與日高溫間的關(guān)系，以及花粉粒萌發(fā)率變化規(guī)律與33℃和35℃以上日高溫持續(xù)時間的關(guān)系，培養(yǎng)溫度與花粉萌發(fā)率的關(guān)系。結(jié)果表明，33℃以上的日高溫影響棉花雄蕊的發(fā)育，高溫持續(xù)時間越長影響越大，雄蕊形成的花粉粒活性越低，花粉萌發(fā)率越

5、低。高溫前期與后期，花粉粒萌發(fā)率存在顯著差異，日高溫是導(dǎo)致花粉萌發(fā)率變化的主要因素?；ǚ勖劝l(fā)率隨著培養(yǎng)溫度升高而降低，花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)溫度在30-35℃時，花粉萌發(fā)率下降幅度最大，品種間差異最大，35℃的培養(yǎng)溫度是篩選陸地棉花粉耐熱的合適溫度。培養(yǎng)溫度35℃下花粉萌發(fā)率較30℃萌發(fā)率的下降率小于41％可認(rèn)為為耐高溫品種，大于41％為感高溫品種。這一指標(biāo)可用于棉花雄蕊耐高溫的篩選。
　　2.陸地棉花粉耐熱性雜種優(yōu)勢研究
　　

6、在高溫前期、高溫期和高溫后期，測定了耐高溫品種、感高溫品種及F1代的花粉萌發(fā)率。結(jié)果表明，陸地棉花蕾發(fā)育受田間高溫影響后，耐高溫品種與感高溫品種雜交F1代花粉粒離體萌發(fā)率呈現(xiàn)明顯的中親優(yōu)勢。高溫前期，雜交F1代離體花粉粒在培養(yǎng)溫度35℃下呈現(xiàn)較高的中親優(yōu)勢。受高溫影響后，雜交F1花粉活力有較強(qiáng)的恢復(fù)能力，在30℃和35℃培養(yǎng)溫度下，花粉萌發(fā)率較高，中親優(yōu)勢較明顯。
　　3.陸地.花粉耐熱性與花藥結(jié)構(gòu)變化及花粉粒內(nèi)細(xì)胞器關(guān)系的研究<

7、br>　　高溫處理耐高溫和感高溫陸地棉品種，觀測了高溫前后花粉萌發(fā)率、花藥結(jié)構(gòu)和花粉粒超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，高溫逆境下，感高溫品種蘇棉16號的花藥內(nèi)畸形花粉粒數(shù)量大于感高溫9650短果枝，蘇棉16號花粉粒內(nèi)部的液泡數(shù)量增多、淀粉粒減少，蘇棉16號花粉粒內(nèi)畸形線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量高于9650短果枝，蘇棉16號花粉萌發(fā)率小于9650短果枝，9650短果枝花粉粒的耐熱性大于蘇棉16號?；ǚ哿Ｄ蜔嵝钥赡芘c花粉形成過程中花藥結(jié)構(gòu)有關(guān)，與花粉粒內(nèi)部的液

8、泡、淀粉粒、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器相關(guān)。受高溫脅迫后，花粉粒耐熱性決定了花粉粒萌發(fā)率的高低。高溫脅迫下，花藥結(jié)構(gòu)和花粉超微結(jié)構(gòu)與花粉粒耐熱性密切相關(guān)。
　　4.陸地.熱激蛋白基因的克隆與功能分析
　　采用RACE法克隆了陸地棉熱激蛋白sHSP2基因（GenBank收錄號為7JQ756321）。sHSP2屬于細(xì)胞質(zhì)Ⅱ類熱激蛋白基因，與細(xì)胞的耐熱性密切相關(guān)。陸地棉葉片和雄蕊中熱激蛋白sHSP2基因表達(dá)量和表達(dá)模式不同。sHSP2

9、在葉片中的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低再升高的雙峰模式，高溫脅迫1h、24h表達(dá)量達(dá)到最大，sHSP2可能在在防止高溫下蛋白質(zhì)變性及聚集沉淀，減緩高溫脅迫對陸地棉植株的傷害方面起重要作用;sHSP2在雄蕊（花藥）中的表達(dá)呈現(xiàn)單峰模式，高溫脅迫12h表達(dá)量達(dá)到最大，sHSP2可能在減緩高溫脅迫對陸地棉雄蕊的傷害方面起重要作用;12h可能是棉花雄蕊對35℃高溫脅迫耐受的閾值。對轉(zhuǎn)sHSP2基因擬南芥功能分析結(jié)果表明，高溫脅迫下轉(zhuǎn)sHSP2基因可以提

10、高擬南芥植株葉綠素和熱激蛋白含量，降低丙二醛的產(chǎn)生，提高了植株的耐熱性。
　　采用RACE法克隆了陸地棉熱激蛋白HSP90基因（GenBank收錄號為3JX843808）。HSP90屬于HSP90基因家族，與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。陸地棉葉片和雄蕊中熱激蛋白HSP90基因表達(dá)量和表達(dá)模式不同。HSP90在葉片中的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低再升高的雙峰模式，高溫脅迫1h、24h表達(dá)量達(dá)到最大，該基因可能在減緩高溫脅迫對陸地棉葉片的傷害

11、中起重要作用。HSP90在雄蕊（花藥）中的表達(dá)呈現(xiàn)單峰模式，高溫脅迫12h表達(dá)量達(dá)到最大，HSP90可能對減緩高溫脅迫對陸地棉雄蕊的傷害起重要作用;12h可能是雄蕊對35℃高溫脅迫耐受的閾值。對轉(zhuǎn)HSP90基因擬南芥功能分析結(jié)果表明，高溫脅迫下轉(zhuǎn)HSP90基因可以提高擬南芥植株葉綠素和熱激蛋白含量，降低丙二醛的產(chǎn)生，提高了植株的耐熱性。
　　本研究的結(jié)論是35℃的培養(yǎng)溫度可以作為陸地棉花粉耐熱篩選溫度。41％的花粉下降幅度可以作為