陸地棉GhbHLH130和GhZFP130基因克隆及功能分析.pdf

1、高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫嚴(yán)重阻礙作物生長(zhǎng)發(fā)育，影響品質(zhì)、產(chǎn)量的形成。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了一整套耐逆性機(jī)制以適應(yīng)、抵御外來(lái)逆境的傷害。研究植物適應(yīng)脅迫過(guò)程中的重要基因的功能，了解其耐逆性分子機(jī)制，利用該基因進(jìn)行基因工程改良，對(duì)于提高植物自身耐逆性有重要意義。迄今為止，在植物中已經(jīng)分離和鑒定的耐逆性基因多達(dá)數(shù)百個(gè)，包括功能基因和調(diào)控基因兩大類(lèi)型。其中，堿性/螺旋-環(huán)-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix，bHLH

2、)家族轉(zhuǎn)錄因子和鋅指蛋白家族廣泛參與植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程。
　　bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子，具有螺旋-環(huán)-螺旋基序而得名，主要通過(guò)與DNA、RNA的結(jié)合或與其他蛋白質(zhì)的相互作用調(diào)控目的基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)該家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物耐非生物脅迫途徑，但在棉花中的研究甚少。鋅指蛋白，因其蛋白結(jié)構(gòu)中含有指狀結(jié)構(gòu)域而得名，鋅指蛋白廣泛分布于植物和動(dòng)物中，根據(jù)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)和功能差異，將鋅指蛋白分為Zim17家族、TFⅢA家族、WRKY家族、PH

3、D家族、GATA家族等。本文主要針對(duì)棉花受非生物逆境脅迫過(guò)程中芯片數(shù)據(jù)顯示bHLH家族基因和鋅指蛋白家族基因表達(dá)量發(fā)生上調(diào)為基礎(chǔ)，分離了bHLH家族基因GhbHLH130和鋅指蛋白家族基因GhZFP130基因，取得如下結(jié)果。
　　1.首次從陸地棉中分離了GhbHLH130基因和GhZFP130基因。同源序列比較表明，GhbHLH130基因編碼了一個(gè)bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子，氨基酸序列表明GhbHLH130有一個(gè)HLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHL

4、H轉(zhuǎn)錄因子，聚類(lèi)分析表明該基因與可可、大豆、水稻中bHLH轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系較近。GhZFP130編碼了一個(gè)Zim17型鋅指蛋白，該鋅指蛋白家族基因研究較少。氨基酸序列表明GhZFP130有一個(gè)zf-DNL結(jié)構(gòu)域，屬于Zim17型鋅指蛋白。多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白與可可、水稻、酵母等Zim17型鋅指蛋白有保守結(jié)構(gòu)域，在其他物種中，該蛋白協(xié)助線(xiàn)粒體蛋白運(yùn)輸進(jìn)入線(xiàn)粒體基質(zhì)，但是很少有學(xué)者研究該類(lèi)型鋅指蛋白的抗非生物脅迫能力?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明在其

5、64-82個(gè)氨基酸和142-160個(gè)氨基酸之間存在兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，因此推測(cè)GhZFP130可能作為一種重要調(diào)控因子起作用。GhZFP130是棉花中首次被克隆的Zim17型鋅指蛋白基因，對(duì)其表達(dá)及功能探索將大大促進(jìn)整個(gè)Zim17型鋅指蛋白家族的研究。
　　2.將GhZFP130-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)，在洋蔥表皮細(xì)胞的線(xiàn)粒體內(nèi)觀察到綠色熒光。GhbHLH30-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)，激光共聚焦

6、顯微鏡下觀察到該蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。
　　3.熒光定量分析GhbHLH130基因和GhZFP130基因在高鹽、干旱、低溫和ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)模式。GhbHLH130基因的表達(dá)受外源ABA、高鹽、干旱、低溫的誘導(dǎo)，且響應(yīng)外源ABA較早，表明GhbHLH130基因?qū)Ω啕}、干旱、低溫的響應(yīng)可能參與了依賴(lài)于ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。GhZFP130基因顯著受干旱、外源ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，但是響應(yīng)低溫和NaCl誘導(dǎo)時(shí)間較晚。PEG6000

7、和外源ABA處理棉花根部，GhZFP130基因顯著上調(diào);GhZFP130基因響應(yīng)NaCl脅迫較晚，NaCl處理6h后，GhZFP130基因上調(diào)表達(dá);低溫處理，GhZFP130基因幾乎不表達(dá);表明GhZFP130基因受PEG6000、外源ABA的顯著誘導(dǎo)，GhZFP130基因可能參與依賴(lài)于ABA信號(hào)通路的抗旱途徑。
　　4.構(gòu)建PBI121-GhbHLH130過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，獲得T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株8株。比較T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株

8、和野生型煙草植株在自然干旱條件下的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)于野生型葉片更加堅(jiān)挺，而野生型煙草葉片出現(xiàn)卷邊。構(gòu)建PBI121-GhZFP130過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株6株。對(duì)野生型和轉(zhuǎn)GhZFP130擬南芥T0代植株在自然條件下進(jìn)行離體葉片失水率試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)野生型和轉(zhuǎn)GhZFP130離體擬南芥葉片迅速失水，但轉(zhuǎn)GhZFP130擬南芥失水率低于野生型。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株比野生型具更高的耐旱性。
　　上述試驗(yàn)表