農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜菜堿基因轉(zhuǎn)化西瓜的初步研究.pdf

1、西瓜(Citrullus lanatus (Thunb.)Matsum．et Nakai)是重要的大眾化水果，原產(chǎn)于非洲，為葫蘆科西瓜屬1年生草本蔓生植物。西瓜的遺傳基礎(chǔ)十分狹窄，常規(guī)育種技術(shù)對(duì)某些性狀的改良較為困難?；蚬こ碳夹g(shù)為定向改良西瓜新品種提供了一條新的途徑。高效離體再生體系的建立是利用基因工程技術(shù)進(jìn)行西瓜種質(zhì)資源改良的基礎(chǔ)。目前對(duì)西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系尚缺乏深入系統(tǒng)的理論研究，迄今為止由于研究者采用的品種、取材方法、培養(yǎng)條件不同及

2、個(gè)人經(jīng)驗(yàn)的差異導(dǎo)致文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論差異較大，甚至完全相反，缺乏可重復(fù)操作性。鑒于這種情況的存在，很有必要對(duì)于西瓜組織再生體系進(jìn)行深入系統(tǒng)的基礎(chǔ)性研究工作。西瓜95％由水構(gòu)成，每年僅北京地區(qū)就需數(shù)千萬(wàn)以至億立方米的水。由于北京地上水很少，又多存于山區(qū)，地上無(wú)水可供，地下水量的不足與需水量不斷增加的矛盾日益尖銳和突出。鑒于此．對(duì)西瓜轉(zhuǎn)化抗旱基因使之節(jié)水勢(shì)在必行。甜菜堿是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以增強(qiáng)植物的抗逆性。由于甜菜堿合成途徑很簡(jiǎn)單，進(jìn)

3、行遺傳操作是方便的，所以甜菜堿合成酶基因被認(rèn)為是最重要和最有希望的脅迫抗性基因之一。本試驗(yàn)試圖通過(guò)篩選高效再生基因型，優(yōu)化西瓜再生體系，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，并將BADH基因?qū)胛鞴?，以獲得抗旱新品種。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.篩選出5種高效再生基因型并優(yōu)化了以西瓜子葉為外植體的離體再生體系 通過(guò)對(duì)23種基因型的比較分析，從中篩選出魯圓、三白、FW351、PM2和京母5種高效再生基因型，他們?cè)谧钸m培養(yǎng)基下獲得的最高不

4、定芽誘導(dǎo)率分別為90.0％，85.0％，82.5％，82.5％和80.0％；芽誘導(dǎo)率低于1096的基因型有兩種，分別是白-HC(7.5％)和中信(0％)，幾乎不能誘導(dǎo)出芽。說(shuō)明不同基因型其不定芽誘導(dǎo)率不同，有明顯的基因型差異。最終優(yōu)化的西瓜離體再生體系為：切取嫩綠色時(shí)的西瓜子葉，置于MS+3.0mg/L,BA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生芽，切芽叢轉(zhuǎn)到MS+0.2mg/LKT培養(yǎng)基上，待芽伸長(zhǎng)到2cm左右時(shí)轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基MS+0.5mg/LIAA上，

5、根系粗壯后，先在1/2MS浸泡過(guò)的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)土中養(yǎng)苗，待長(zhǎng)出新根后再移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中。 2.建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系 通過(guò)對(duì)影響西瓜轉(zhuǎn)化效率的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間及侵染液濃度等各項(xiàng)因素進(jìn)行比較試驗(yàn)，確定了最終的轉(zhuǎn)化條件：切取轉(zhuǎn)化受體材料在培養(yǎng)基MS+3.0mg/LBA中預(yù)培養(yǎng)1～2d。將二次活化至OD600=0.4的菌液離心，重懸于相同體積添加200 μmol/L乙酰丁香酮的MS液體

6、培養(yǎng)基中，將預(yù)培養(yǎng)葉片放入其中，侵染10min，滅菌濾紙吸干，放入添加200μmol/L乙酰丁香酮的培養(yǎng)基MS+3.0mg/LBA中，暗培養(yǎng)3～4d。共培養(yǎng)結(jié)束后，將葉片在附加300mg/LCef的1/2MS液體培養(yǎng)基中輕輕振蕩洗滌30min，滅菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)入MS+3.0mg/LBA+100mg/LKm+300mg/LCb中進(jìn)行篩選分化培養(yǎng)，出芽后轉(zhuǎn)入MS+0.2mg/LKT+75mg/LKm+100mg/LCb)中進(jìn)行增殖篩選。再生