非培養(yǎng)方法和培養(yǎng)方法對水稻內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌的研究.pdf

1、本文對非培養(yǎng)方法在水稻內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌研究中的應(yīng)用進(jìn)行了探索。主要采用了構(gòu)建16SrRNA基因克隆文庫、DGGE兩種非培養(yǎng)方法并結(jié)合傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，對水稻(OryzasativaL.)內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌群落多樣性及群落動態(tài)變化進(jìn)行了研究。 建立了直接從水稻根組織擴(kuò)增內(nèi)生細(xì)菌16SrDNA的方法。選擇了擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的引物(799f-1492r)，該對引物可以通過PCR的方法直接從水稻根總DNA中擴(kuò)增出內(nèi)生細(xì)

2、菌的16SrDNA片段，而不擴(kuò)增水稻葉綠體DNA。水稻線粒體DNA可通過擴(kuò)增產(chǎn)物中片段大小差異與細(xì)菌的16SrDNA分開。通過對水稻內(nèi)生細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫中陽性克隆的序列測定證實(shí)該對引物完全適用于非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法對水稻內(nèi)生細(xì)菌的研究。該項(xiàng)研究結(jié)果尚未見報(bào)道。 對分蘗期水稻(OryzasativaL.japonica90-3)的內(nèi)生細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫中192個(gè)陽性克隆的16SrDNA片段進(jìn)行ARDRA

3、分型，根據(jù)ARDRA分型結(jié)果將該克隆文庫分為52個(gè)OTUs；16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析揭示水稻根內(nèi)生細(xì)菌中包含α-、β-、γ-、δ-、ε-五個(gè)亞類的Proteobacteria，其中γ-Proteobacteria為克隆文庫中最優(yōu)勢的細(xì)菌類群，占克隆總數(shù)的25％。除此之外水稻根內(nèi)生細(xì)菌中還含有低GC的革蘭氏陽性細(xì)菌及Cytophaga/Flexibacter/Bacteroides(CFB)類細(xì)菌。文庫中28.64％的克隆與尚未培養(yǎng)

4、的細(xì)菌具有較高的序列相似性。該文庫中還有6個(gè)克隆屬于古菌，這是首次通過非培養(yǎng)方法研究證實(shí)水稻內(nèi)生菌群落中包含有古菌。這些結(jié)果均說明水稻內(nèi)生菌具有豐富的種群多樣性。 采用構(gòu)建細(xì)菌16SrDNA克隆文庫并結(jié)合分離培養(yǎng)方法，研究了水稻根結(jié)合細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。ARDRA分型結(jié)果顯示，克隆文庫包含43個(gè)OTUs，分離培養(yǎng)物包含17個(gè)OTUs。 兩種研究方法的結(jié)果均說明γ-Proteobacteria為水稻根結(jié)合細(xì)菌群落中的優(yōu)勢類群。氣

5、單胞菌屬為克隆文庫中的最優(yōu)勢菌群；與16SrDNA克隆文庫比較，分離培養(yǎng)物中的最優(yōu)勢菌群則為假單胞菌屬。 采用PCR-DGGE技術(shù)研究了在水稻生長的不同年份及不同生長時(shí)期兩個(gè)品種的水稻(OryzasativaL.japonica90-3，OryzasativaL.japonica90-12)根內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌的群落多樣性及其動態(tài)變化。DGGE圖譜中主要條帶的序列分析結(jié)果顯示，水稻內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌群落中均有α-、β-、γ-

6、、δ-四個(gè)亞類的Proteobacteria及低GC的革蘭氏陽性細(xì)菌存在。DGGE圖譜分析結(jié)果顯示，水稻根內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性受植物品種、生長時(shí)期等因素的影響，與水稻抽穗期相比，分蘗期水稻根內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性較高，并且高抗病品種的內(nèi)生細(xì)菌多樣性更為豐富；水稻的不同生長時(shí)期對根結(jié)合細(xì)菌群落的影響較大，但未發(fā)現(xiàn)栽培品種的不同對水稻根結(jié)合細(xì)菌群落有明顯的影響。 以分離培養(yǎng)方法研究了水稻(品種：90-3)2005年分蘗初期樣品的內(nèi)生細(xì)菌，

7、共分離到9個(gè)屬的181株細(xì)菌，而相同樣品DGGE圖譜中含有28條帶，其群落多樣性較培養(yǎng)方法得到的明顯豐富許多。分離物的16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析表明，根瘤菌屬(Rhizobrium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)為最優(yōu)勢菌屬。同一樣品DGGE圖譜中的主要條帶序列分析結(jié)果顯示，梭菌屬(Clostridium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)及不動桿菌屬(Acinetobacter)為內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢

8、菌屬。非培養(yǎng)方法與培養(yǎng)方法相比，結(jié)果差別較大。 據(jù)目前所知，本研究應(yīng)用非培養(yǎng)方法研究首次發(fā)現(xiàn)水稻內(nèi)生細(xì)菌群落中有Delftia屬細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)水稻根結(jié)合細(xì)菌群落中包含有Rheinheimera屬和Dechloromonas屬的細(xì)菌；首次應(yīng)用培養(yǎng)方法分離到水稻內(nèi)生細(xì)菌Chryseobacteriumtaichungense和Paenibacillusbarcinonensis；首次從水稻根部分離到Rheinheimerabaltic