桉樹固有內(nèi)生細(xì)菌去除及恢復(fù)培養(yǎng)研究.pdf

1、植物內(nèi)生細(xì)菌被廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治,桉樹青枯病是由茄拉爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種系統(tǒng)性維管束病害,給桉樹產(chǎn)業(yè)帶來了極大的損失,本研究通過對桉樹固有內(nèi)生細(xì)菌去除探索桉樹抗病性與內(nèi)生細(xì)菌種群的關(guān)系,并且通過恢復(fù)培養(yǎng)擴(kuò)大內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)范圍,為篩選生防菌尋找更廣泛的途徑。
　　 1、桉樹莖尖誘導(dǎo)愈傷組織及單細(xì)胞培養(yǎng)
　　 采用電鏡法檢測尾葉桉實生苗莖尖內(nèi)生細(xì)菌,選取長度為1.5 mm左右

2、的尾葉桉莖尖,篩選適宜的莖尖分化培養(yǎng)基及莖尖誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基,機(jī)械法分離愈傷組織單細(xì)胞,為獲得由單細(xì)胞培養(yǎng)再生桉樹組培苗奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),電鏡觀察桉樹莖尖未檢測到內(nèi)生細(xì)菌;莖尖最適生長培養(yǎng)基為:MS+NAA0.1 mg／L+6-BA0.2 mg／L+3％蔗糖+0.8％Agar；莖尖愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為:MS+2 mg／L2,4-D+3％蔗糖+0.4％Agar,愈傷組織較為疏松,利于單細(xì)胞分散；震蕩培養(yǎng)后獲得均勻單細(xì)胞懸浮液,

3、經(jīng)平板培養(yǎng)成功分離單細(xì)胞,經(jīng)檢測細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)生細(xì)菌。所以,機(jī)械法分離莖尖愈傷組織單細(xì)胞是一種有效的途徑,并且為無內(nèi)生細(xì)菌桉樹組培苗的獲得提供了新的思路。
　　 2、熱處理和抗生素對桉樹固有內(nèi)生細(xì)菌的去除
　　 為了獲得無內(nèi)生細(xì)菌干擾的尾葉桉組培苗,本試驗采用尾葉桉種子干熱和濕熱處理、組培苗熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)、組培苗抗生素處理三種方法去除內(nèi)生細(xì)菌,并用透明染色法和血球計數(shù)法對其體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌群體存在及數(shù)量的變化開展了研究。結(jié)

4、果表明,尾葉桉種子經(jīng)干熱45℃1 d、50℃2 d、濕熱35℃3 d、45℃1 d、45℃2 d處理后,內(nèi)生細(xì)菌含量均明顯低于對照組,約是對照組的1／3,說明對細(xì)菌增殖有抑制作用,但經(jīng)濕熱處理后尾葉桉種子萌發(fā)率降低,另外45℃高溫干熱及35℃濕熱處理種子后促使種子提早萌發(fā),起到催芽作用；組培苗恒溫37℃熱處理第20 d、21 d其莖尖內(nèi)生細(xì)菌含量分別為5.33×108 CFU／g、4.02×108 CFU／g,約是對照組3.43×109

5、 CFU／g的1／7,變溫恢復(fù)熱處理后均低于對照組7.70×109 CFU／g,當(dāng)處理溫度達(dá)到40℃時內(nèi)生細(xì)菌含量最低,為1.63×108 CFU／g,約是對照組的1／47,說明抑制效果最好；土霉素、四環(huán)素、頭孢菌素處理均使桉樹體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量增加；所以,熱處理對桉樹內(nèi)生細(xì)菌有一定的抑制作用,但并不能徹底去除,三種抗生素處理都沒有抑制作用；利用透明染色法觀察植物葉片內(nèi)生細(xì)菌能更直觀有效地檢測內(nèi)生細(xì)菌在植物組織內(nèi)的分布。
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6、、桉樹固有內(nèi)生細(xì)菌的激活培養(yǎng)
　　 尾葉桉組培苗采用澆淋菌液法,分別接種濃度為1×108 CFU／mL的外源內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌CN030菌懸液及其代謝液。結(jié)果發(fā)現(xiàn),從第5 d起桉樹苗接種菌懸液后其體內(nèi)固有內(nèi)生細(xì)菌開始恢復(fù)培養(yǎng)特性,隨著分離時間的不同,可培養(yǎng)內(nèi)生菌的種類也出現(xiàn)差異,獲得至少6株優(yōu)勢內(nèi)生菌株,大多數(shù)為革蘭氏陽性菌。對其中4種可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)16S rDNA克隆測序結(jié)果分析,1號與亞麻短桿菌Brevibacteri

7、um linens和金黃桿菌Brevibacterium aureum同源性達(dá)到99.0％,2號與成團(tuán)泛菌Pantoea agglomerans同源性達(dá)到99.5％,3號與枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis subsp.subtilis同源性達(dá)到99.5％,4號與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens同源性達(dá)到99.1％。