東方擬無(wú)枝酸菌HCCB10007發(fā)酵組分的研究.pdf

1、萬(wàn)古霉素是目前臨床上用于治療由MRSA引起的嚴(yán)重感染疾病的首選藥物，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。隨著萬(wàn)古霉素應(yīng)用和研究的深入，對(duì)其有效組分和相關(guān)物質(zhì)的分析鑒定越來(lái)越引起關(guān)注。國(guó)產(chǎn)萬(wàn)古霉素雖已上市數(shù)年，但其相關(guān)物質(zhì)的研究未見(jiàn)深入報(bào)道。隨著萬(wàn)古霉素耐藥菌的不斷出現(xiàn)，也引發(fā)了人們對(duì)萬(wàn)古霉素持續(xù)有效性的擔(dān)心?；谶@種狀況，開(kāi)發(fā)治療耐藥菌所引起感染的新型糖肽類(lèi)抗生素勢(shì)在必行。 本論文就是試圖建立國(guó)產(chǎn)萬(wàn)古霉素中相關(guān)物質(zhì)的分離純化方法，并對(duì)其進(jìn)行分析

2、、鑒定。同時(shí)考察發(fā)酵條件對(duì)萬(wàn)古霉素及相關(guān)成分的影響，獲得產(chǎn)物各異的各種發(fā)酵培養(yǎng)基。并對(duì)發(fā)現(xiàn)的各種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化、應(yīng)用，為糖肽類(lèi)抗生素的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 所取得的主要成果包括： (1)詳細(xì)研究了國(guó)產(chǎn)萬(wàn)古霉素中的有關(guān)組分，并將其與USP標(biāo)準(zhǔn)品、EP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行類(lèi)比。通過(guò)篩選獲得一種具有特異性吸附作用的弱極性大孔吸附樹(shù)脂b，結(jié)合中壓液相色譜和高效液相色譜技術(shù)，從發(fā)酵液及粗品中分離得到七個(gè)組分。通過(guò)MS分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及

3、有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)測(cè)試鑒定出其中五個(gè)組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分別為：去甲萬(wàn)古霉素，脫氨基萬(wàn)古霉素B<,1>、B<,2>，單糖萬(wàn)古霉素，無(wú)糖萬(wàn)古霉素。五個(gè)組分均為萬(wàn)古霉素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，其中脫氨基萬(wàn)古霉素B<,1>、B<,2>是一對(duì)同分異構(gòu)體，在溶液中以一定比例共存。另兩個(gè)組分的分子量分別為1318D、1459D。并對(duì)分離得到的各組分的理化性質(zhì)及體外活性進(jìn)行了初步研究：其中無(wú)糖萬(wàn)古霉素的體外活性高于萬(wàn)古霉素。 (2)考察了東方擬無(wú)枝酸菌HCCB1

4、0007在不同發(fā)酵條件，主要是不同氮源培養(yǎng)基下各發(fā)酵產(chǎn)物的變化情況。研究中發(fā)現(xiàn)了萬(wàn)古霉素及其他組分含量有顯著變化的三種發(fā)酵培養(yǎng)基：萬(wàn)古霉素效價(jià)1200μg·ml<'-1>左右、發(fā)酵液中百分含量高于70％，其他組分含量大幅度降低的合成培養(yǎng)基；組分變化不明顯，但萬(wàn)古霉素產(chǎn)量提高21％的菌渣酵母培養(yǎng)基；以及發(fā)酵產(chǎn)生無(wú)氯萬(wàn)古霉素的培養(yǎng)基。對(duì)前兩種有應(yīng)用價(jià)值的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，為其他相關(guān)工作提供了基礎(chǔ)。對(duì)無(wú)氯萬(wàn)古霉素進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)其產(chǎn)

5、生條件進(jìn)行了考察。直接發(fā)酵獲得到的該物質(zhì)雖然體外活性低于萬(wàn)古霉素，但有望成為新萬(wàn)古霉素衍生物的前體物質(zhì)。 (3)將合成培養(yǎng)基分別應(yīng)用于東方擬無(wú)枝酸菌HCCB10007的基因工程菌HCCB10072、HCCB10081的發(fā)酵驗(yàn)證中，發(fā)酵結(jié)果要優(yōu)于對(duì)照培養(yǎng)基，通過(guò)發(fā)酵方法得到了萬(wàn)古霉素的糖苷配基；對(duì)茵渣酵母培養(yǎng)基進(jìn)行了5L發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn)，萬(wàn)古霉素發(fā)酵單位高于對(duì)照。并且進(jìn)行了菌渣酵母的循環(huán)替代實(shí)驗(yàn)，初步研究了萬(wàn)古霉素菌渣循環(huán)利用的可