桑樹(shù)內(nèi)生菌Micrococcusluteus-Y2發(fā)酵產(chǎn)DNJ的研究.pdf

1、1-脫氧野尻霉素（DNJ）是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，能有效抑制糖吸收，降低血糖值。桑根皮在中國(guó)古代就被用作治療“消渴癥”的良藥?，F(xiàn)代科學(xué)已經(jīng)證明，桑樹(shù)中降血糖的主要有效成分是DNJ。鑒于此，前人已經(jīng)對(duì)不同桑品種、桑樹(shù)不同部位、不同葉位、不同季節(jié)、不同產(chǎn)地、甚至多種食桑昆蟲(chóng)的DNJ 含量進(jìn)行了研究，但是桑樹(shù)體內(nèi)DNJ的來(lái)源尚未有明確的研究結(jié)果。
　　 目前，從中藥材中提取以及利用植物內(nèi)生菌獲得具有療效的活性物質(zhì)成為藥物研究的重要

2、方向。本實(shí)驗(yàn)室在前期試驗(yàn)中已經(jīng)從桑樹(shù)中分離到兩株產(chǎn)DNJ的內(nèi)生菌：嗜麥芽寡養(yǎng)假單孢桿菌（Stenotrophomonas maltophilia）Y1和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）
　　 Y2。本文對(duì)Y2菌株的生理生化指標(biāo)和生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定；研究了Y2菌株產(chǎn)DNJ的最佳發(fā)酵條件和發(fā)酵配方，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了初步分離提純；建立了體外α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定模型，測(cè)定了Y1和Y2 發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)α-葡萄

3、糖苷酶的抑制活性。同時(shí)，為探討桑樹(shù)中的DNJ 來(lái)源，本試驗(yàn)還測(cè)定了桑樹(shù)無(wú)菌苗的DNJ 含量。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.測(cè)定了Y2菌株的生理生化指標(biāo)和生物學(xué)特性，結(jié)果表明Y2 與藤黃微球菌的鑒定特征相符。Y2菌株接種后36 h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,36 h～60 h是生長(zhǎng)穩(wěn)定期，60 h后開(kāi)始衰老；菌株適宜生長(zhǎng)的溫度是25℃～35℃，可耐受最低生長(zhǎng)溫度為4℃，最高為40℃，最適生長(zhǎng)溫度為30℃；該菌株較適宜的pH范圍是6.5～8.0

4、，其中最適宜的pH是7.0，適宜在中性偏堿性條件下生長(zhǎng)，并有較強(qiáng)的耐鹽性。
　　 2.通過(guò)搖瓶培養(yǎng)方法，探討了環(huán)境條件和培養(yǎng)基組分對(duì)Y2菌株產(chǎn)DNJ的影響。
　　 利用單次單因子試驗(yàn)確定了搖瓶發(fā)酵的最佳條件為：接種量2％（v/v）、搖瓶裝液量50 mL/250 mL、發(fā)酵溫度30℃、初始pH7.0，發(fā)酵時(shí)間30 h。
　　 在此基礎(chǔ)上通過(guò)單次單因子試驗(yàn)確定了搖瓶發(fā)酵配方的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽組合。運(yùn)用PB 部分

5、因子試驗(yàn)分析了培養(yǎng)基組分：蛋白胨、麥芽糖、MgSO4、KH2PO4、NaCl 對(duì)Y2菌株產(chǎn)DNJ的影響。結(jié)果表明，蛋白胨對(duì)Y2菌株發(fā)酵產(chǎn)DNJ的影響達(dá)到極顯著水平，KH2PO4 對(duì)Y2菌株發(fā)酵產(chǎn)DNJ的影響達(dá)顯著水平，而麥芽糖、MgSO4、NaCl 對(duì)Y2菌株發(fā)酵產(chǎn)DNJ的影響不顯著。通過(guò)最陡爬坡路徑試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，確定了主要影響因子的最佳濃度。
　　 最優(yōu)化培養(yǎng)基為：麥芽糖20.00 g、

6、蛋白胨36.53G、KH2PO4 2.22 g、MgSO4 0.5 g、NaCl 4 g、去離子水1000 mL。
　　 運(yùn)用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，利用RP-HPLC-UV法測(cè)得發(fā)酵液中DNJ的濃度達(dá)到了213.18 μg/ml，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基DNJ 濃度值提高了184.63％。
　　 3.對(duì)Y2菌株產(chǎn)生的DNJ 進(jìn)行了初步分離純化。Y2菌株發(fā)酵樣品進(jìn)行濃縮后，又經(jīng)過(guò)乙醇沉淀、過(guò)NKA-9 型大孔吸附樹(shù)

7、脂和強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂，最后的樣品經(jīng)過(guò)濃縮、冷凍干燥成樣品。提取物衍生化后利用RP-HPLC-UV法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該純化工藝去除了大量雜質(zhì)，色譜圖中的雜峰大大減少，DNJ 含量達(dá)到了0.337％，較之前提高了5.3倍。
　　 4.通過(guò)體外α-葡萄糖苷酶抑制模型測(cè)定了Y1、Y2菌株發(fā)酵液提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。結(jié)果表明：兩種內(nèi)生菌發(fā)酵分離物都具有很強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且最終抑制活性均高于對(duì)照藥物阿卡波

8、糖，菌株Y2 發(fā)酵液提取物的抑制中濃度為111.58 mg/L，菌株Y1 發(fā)酵液提取物的抑制中濃度為2307.56 mg/L，分離物的抑制活性均與濃度呈正相關(guān)，其抑制活性具有劑量依賴(lài)性。
　　 5.檢測(cè)了桑樹(shù)無(wú)菌苗的DNJ 含量。運(yùn)用細(xì)菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基對(duì)桑樹(shù)無(wú)菌苗內(nèi)的內(nèi)生菌檢測(cè)培養(yǎng)，平板中沒(méi)有雜菌生長(zhǎng)，推斷桑樹(shù)組培苗脫毒成功，已無(wú)內(nèi)生菌在其體內(nèi)共生。桑樹(shù)無(wú)菌組培苗干物中DNJ 含量檢測(cè)結(jié)果為0.197％，與大田中的桑樹(shù)DNJ