人發(fā)角蛋白—膠原海綿—聚甲基丙烯酸羥乙酯復合生物敷料的研制.pdf

1、第一部分 人發(fā)角蛋白-膠原海綿的組織相容性和生物可降解性評價 有關(guān)HHK的化學成分、性質(zhì)，生物學性能，生物、組織相容性及HHK人工腱的生物力學性能等，我們的前期研究中已闡明，但其在皮膚組織工程中的應用尚鮮有報道。膠原海綿已廣泛用作皮膚的支架材料，但其易收縮、機械強度小等缺點依然是亟待解決的課題。 目的：研究HHK-膠原海綿體內(nèi)的組織相容性和生物降解性 方法： 1、用可控性的物理、化學處理方法制備具有輕(Ⅰ

2、)、中(Ⅱ)、重(Ⅲ)不同處理程度的三種HHK組分材料。 2、用牛跟腱為原料，經(jīng)酸溶解、抽提、離心、鹽析等步驟制備Ⅰ型膠原(經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)電泳證實)，并與6-硫酸軟骨素進行初交聯(lián)。3、將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種組份的絲狀HHK以3∶3∶4的比例編織成網(wǎng)孔大小為1×1mm2的網(wǎng)格狀支架，與Ⅰ型膠原蛋白一同置于模具內(nèi)經(jīng)真空冷凍干燥后成膜，制成HHK-膠原海綿膜。 4、將HHK-膠原海綿復合膜置于0.25％的戊二醛

3、溶液中浸泡再交聯(lián)，反復漂洗后干燥備用。 5、成品的膠原海綿經(jīng)掃描電鏡觀察海綿狀結(jié)構(gòu)，測其孔徑大小。 6、實驗設(shè)計和分組：將大小均為1×1cm2的“三”種材料(實驗組植入HHK-膠原海綿，陽性對照組單純植入膠原海綿，陰性對照組不植入任何材料)分別埋植于21只SD大鼠背部皮膚的真皮與皮下組織之間，以背部正中線為軸，每只大鼠背部制作6處埋植區(qū)域(左右各3個)，每組2處。分別于術(shù)后3天、1周、2周、4周、6周、8周和12周，隨機

4、選取3只大鼠，行材料及其周圍組織取材，常規(guī)H.E.染色、彈性蛋白染色及掃描電鏡觀察，分析材料的組織相容性、降解情況及對新生組織的血管化作用。 結(jié)果： 1、HHK-膠原海綿膜材料特性SDS-PAGE電泳圖譜分析所抽提膠原α1(Ⅰ)帶的顏色深度是α2(Ⅰ)帶的2倍。Ⅰ型膠原的三條螺旋鏈為(2α1(Ⅰ)]α2(Ⅰ)。兩次交聯(lián)后的HHK-膠原海綿膜0.1-0.2cm厚，質(zhì)韌，有彈性，隨形性好。掃描電鏡觀察：粗細不等的膠原纖維呈不

5、規(guī)則立體多孔狀結(jié)構(gòu)，80％的孔徑平均在150-200μm。 2、HHK-膠原海綿膜的組織相容性和降解吸收 1)移植后大體觀察：各組均無創(chuàng)口感染、組織滲液或移植物排斥反應。取材見，移植物表面包裹有薄層的纖維囊，不易與周圍的纖維組織分離開。 2)移植后光鏡下觀察：HHK-膠原海綿和單純膠原海綿植入早期均有較明顯的炎癥反應，以中性粒細胞和單核細胞為主；第2周，炎癥反應明顯減輕，實驗組成纖維細胞增生活躍，分泌少量膠原，材

6、料周圍新生血管數(shù)量增多。HHK及膠原海綿開始降解；第6周，實驗組分泌膠原纖維排列趨于整齊，表皮層愈合良好。HHK材料部分降解，膠原海綿基本消失。實驗組醛復紅彈性纖維染色可見細長條狀彈性纖維；第12周，HHK材料完全降解。 3)電鏡下觀察，第2周，實驗組材料周圍可見膠原纖維和彈性纖維；毛小皮降解、剝離；膠原海綿膜內(nèi)可見血管斷面。 結(jié)論：HHK-膠原海綿復合膜組織相容性和生物降解性良好，且降解產(chǎn)物對機體無毒、無免疫排斥反應。

7、 第二部分 人發(fā)角蛋白－膠原海綿－聚甲基丙烯酸羥乙酯復合生物敷料對深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面的促愈作用 本實驗設(shè)計將HHK－膠原海綿作為敷料內(nèi)層，不用更換；將PHEMA/PD藥物緩釋載體膜作為敷料外層，具有保濕和緩釋藥物的作用可更換。通過與臨床應用較廣的戊二醛豬皮敷料作陽性對照，以無菌紗布作為陰性對照組，比較不同時期的創(chuàng)面形態(tài)學及新生組織的變化，創(chuàng)面愈合率及愈合時間。評價HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復合生物敷料對深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面

8、的促愈作用及生物活性。 目的：研究HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復合生物敷料對深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面的治療作用。 方法： 1、PHEMA的合成以丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯為甲基丙烯酸羥乙酯的反應物，以過氧化苯甲酰為引發(fā)劑，經(jīng)回流、滴加等步驟完成甲基丙烯酸羥乙酯的聚合反應。將PD按一定比例溶于乙醇，與制備好的聚丙烯酸羥乙酯載體充分混勻后成膜。將PHEMA/PD膜浸泡于500ml蒸餾水中，用紫外光譜儀于5min，10min，

9、30min，1h，2h，4h，6h……不同時間點測定浸提液中PD的含量。 2、大鼠深Ⅱ°燒傷動物模型用盛有85℃的熱水，底徑為1.5cm的小燒杯，緊貼于脫毛后的大鼠背部皮膚15s，制備大鼠深Ⅱ°燒傷動物模型(經(jīng)病理切片證實)，以背部正中線為軸，每只大鼠左右各制作3個創(chuàng)面。 3、實驗分組創(chuàng)面制備后3天，對正中線一側(cè)的3個創(chuàng)面行切痂、清洗消毒處理，同時分別覆以實驗組(HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復合生物敷料)、陽性對照

10、組(戊二醛豬皮組)和陰性對照組(無菌紗布組)的三種敷料(以后統(tǒng)稱創(chuàng)面處理)，另一側(cè)如法炮制。PHEMA/PD和無菌紗布隔日換藥，觀察創(chuàng)面肉芽組織生長情況。術(shù)后以創(chuàng)面完全上皮化為標準，記錄創(chuàng)面愈合時間，于7d，14d和21d計算創(chuàng)面愈合率。于切痂覆敷料后1周、2周、4周、6周和8周，分別隨機選取3只大鼠，切取整個創(chuàng)面及其周圍組織，行H.E.染色形態(tài)學觀察、新生血管計數(shù)、膠原纖維及彈性纖維的免疫組織化學染色觀察。取標本前，將制備的膠原海綿與

11、醫(yī)用藥棉分別進行斷尾止血實驗，分別記錄止血時間及出血量，比較二者的止血效果。 4、數(shù)據(jù)分析用完全隨機設(shè)計資料的方差分析方法比較3組的新生血管數(shù)和愈合時間。重復測量方差分析方法分析不同時間點的創(chuàng)面愈合率。用獨立樣本的非參數(shù)檢驗比較膠原海綿與醫(yī)用藥棉的止血時間和出血量。 結(jié)果： 1、PHEMA/PD緩釋實驗48小時(h)時，吸光度值最大，其后維持恒定。說明PHEMA膜在0-48h隨時間推移藥物PD不斷釋放，48h釋放

12、完全。 2、大體觀察SD大鼠背部燒傷后，創(chuàng)口邊緣的正常組織充血明顯，創(chuàng)面輕度腫脹，無水泡，創(chuàng)面皮膚蒼白無生機。傷后2-3日，創(chuàng)面壞死組織形成干硬的暗紅色焦痂。2天后換敷料時，見實驗組敷料均緊貼創(chuàng)面，濕度適宜。陽性對照組豬皮敷料仍呈灰白色，與創(chuàng)面貼附好，無浮動感。陰性對照組創(chuàng)面有少量滲血及滲液。 3、光鏡下形態(tài)學觀察 1)燒傷后48小時，大量組織變性壞死，表皮及毛囊上皮細胞腫脹或缺如，胞漿濃縮，核固縮，細胞界限不清

13、。膠原纖維變性壞死，排列紊亂。 2)創(chuàng)面處理后2周，各組創(chuàng)面肉芽組織灶形成，成纖維細胞增殖活躍，并分泌較細小的膠原纖維填充創(chuàng)面。實驗組較陽性對照組更明顯，陰性對照組次之。新生組織中可見新生的毛細血管，實驗組、陽性對照組較陰性對照組多(P=0.003,P=0.022P＜0.05)。 3)實驗組及陽性對照組在創(chuàng)面處理后4周均基本愈合，陰性對照組過半例數(shù)愈合。創(chuàng)面肉芽組織明顯增厚。新生毛細血管增殖旺盛且管腔增大，陽性對照組更明

14、顯。 4)第8周，三組創(chuàng)面均愈合良好。實驗組及陽性對照組膠原纖維束改造塑形，無瘢痕形成趨勢。陰性對照組愈合的表皮層細胞對合不好及真皮層組織排列紊亂。 4、免疫組織化學法檢測 1)創(chuàng)面處理后2w，實驗組創(chuàng)面真皮基質(zhì)中，Ⅰ型膠原呈棕黃色細密條帶狀；且有少量被染成棕黃色細絲狀的彈性纖維，陽性對照組不明顯，陰性對照組中無彈性蛋白的陽性表達。 2)第4周，實驗組及陽性對照組均可見真皮基質(zhì)中呈棕黃色粗大的條帶或片狀的

15、Ⅰ型膠原的強陽性表達。且實驗組彈性蛋白的陽性表達較第2周時增加。 3)第6周，彈性蛋白的免疫組織化學顯示，陰性對照組中僅見散在表達。 5、創(chuàng)面愈合時間實驗組與陽性對照組平均愈合時間的差異無顯著性(P=0.387P＞0.05)，而實驗組和陽性對照組的愈合時間均較陰性對照組平均愈合時間短(P=0.000P＜0.05)。 6、創(chuàng)面愈合率實驗組和陽性對照組在第14和21天的愈合率均較陰性對照組高(p=0.000P＜0.0

16、5)。實驗組僅在第14天，愈合率較陽性對照組高(p=0.046P＜0.05)。 7、止血時間膠原海綿止血組的止血時間及出血量均小于醫(yī)用藥棉止血組(Z=-4.334P=0.000P＜0.05)(Z=-2.468P=0.014P＜0.05)。 結(jié)論：HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復合生物敷料可能通過誘導真皮內(nèi)未分化間充質(zhì)干細胞分化為成纖維細胞，并活化成纖維細胞合成、分泌膠原蛋白和彈性蛋白等。刺激血管形成，在體內(nèi)構(gòu)建組織工