納米鉆石靶向載藥體系的制備及其與細胞相互作用的研究.pdf

1、由于環(huán)境污染日益嚴重和人們不良的生活習慣,導(dǎo)致癌癥的高發(fā)病率,以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于癌癥治療的低效,導(dǎo)致其高的死亡率。在傳統(tǒng)的癌癥治療方法中,化學(xué)療法被認為是最簡便有效的方法之一。但是由于癌癥確診較晚,以及抗癌藥物多為小分子化合物,血液給藥后快速擴散,分布于全身,在殺死腫瘤細胞的同時也對分裂較快的正常細胞有較大的毒副作用,且多次給藥后腫瘤細胞易產(chǎn)生多藥耐藥性,特別是固態(tài)腫瘤,從而導(dǎo)致化療的失敗。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,納米醫(yī)藥為腫瘤的診斷和治療提

2、供了新的思路。納米技術(shù)在影像醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用可提高其檢測靈敏度,如磁共振成像技術(shù)、超聲成像技術(shù)及X-射線計算斷層攝影技術(shù)等,近期隨著活體成像技術(shù)和多光子激發(fā)掃描技術(shù)等的發(fā)展,推動了熒光成像在腫瘤診斷中的應(yīng)用,這些新技術(shù)的發(fā)展使腫瘤的早期確診成為可能。此外利用腫瘤新生血管的不完整結(jié)構(gòu)導(dǎo)致納米顆粒在腫瘤附近的高透過高滯留效應(yīng),可將抗癌藥物制備成納米藥物或裝載在納米載體上可達到被動靶向治療腫瘤的效果,進一步在納米顆粒表面修飾一些與腫瘤細胞或新

3、生血管具有特異性結(jié)合的配體,得到主動靶向到腫瘤的目的,即靶向輸送藥物體系。該體系可以降低抗癌藥物的用量和毒副作用,同時也可抑制腫瘤細胞的多藥耐藥性,提高治療效率。現(xiàn)研究的納米載體材料主要有脂質(zhì)體、高分子聚合物、碳納米管、膠束、納米微球及一些天然高分子化合物等。最近,具有生物相容性好、光學(xué)與化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、合成技術(shù)成熟和表面易于修飾等諸多優(yōu)點的納米鉆石在生物領(lǐng)域的應(yīng)用成為當前研究的熱點,以納米鉆石作為藥物載體和熒光成像試劑還處于研究初期。<

4、br>　　本論文以爆炸合成的納米鉆石(ND)作為載體材料,聚乙二醇(PEG)作為交聯(lián)劑,轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)為靶向分子,對ND進行修飾制備得到靶向腫瘤細胞的納米載體。以阿霉素(DOX)為藥物模型,正常人肝細胞(L-02細胞)和肝癌細胞(HepG2細胞)為細胞模型,對納米載藥體系與細胞的相互作用和載藥體系在細胞內(nèi)的藥物緩釋及靶向性進行了研究。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.使用電導(dǎo)返滴定法對強酸氧化處理后的ND表面羧酸含量進行測定,計算得到

5、每個粒徑為~140nm的ND粒子表面含有3.36×105個羧基。
　　2.對ND物理吸附行為進行了研究,結(jié)果表明,Cit3-可以加強ND對DOX的吸附,同時驗證了Cl-可以調(diào)控DOX從ND上的解離;對Tf的吸附行為符合Langmuir等溫吸附,在PBS(pH7.4)中最大吸附量為(176.46±2.13)μg/mg,在pH(5.5)等于Tf的等電點附近有最大吸附,可能是因為Tf在等電點時溶解度最小,與ND的疏水作用力增大,吸附能力

6、增強。利用激光共聚焦和流式細胞儀對ND和ND-Tf內(nèi)吞到HepG2細胞的差異進行了定性和定量分析,結(jié)果得到ND-Tf比ND容易內(nèi)吞到細胞中,利于可發(fā)熒光的ND在胞內(nèi)成像。
　　3.對ND進行PEG修飾后可提高其分散性,利于細胞內(nèi)吞。對細胞內(nèi)吞ND-PEG-DOX納米載藥體系進行了研究,證明HepG2細胞內(nèi)吞ND-PEG-DOX的速率比游離DOX慢2倍,但是進入細胞的DOX量明顯比游離的DOX內(nèi)吞量增加,并降低了DOX的細胞毒性。使

7、用流式細胞儀測定細胞內(nèi)吞ND-PEG-DOX后胞內(nèi)ND的熒光強度與側(cè)向角的變化呈一致的趨勢,故可以使用側(cè)向角的變化來判斷細胞內(nèi)吞納米顆粒的量。使用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)吞ND-PEG-DOX的過程,表明FND-PEG-DOX對DOX具有緩釋效應(yīng)。細胞內(nèi)吞ND-PEG-DOX的機理為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程,與DOX的自由擴散進入細胞的機理不同。
　　4.以Tf為靶向分子,成功構(gòu)建了ND-PEG-Tf納米靶向藥物載體,使用流式細胞

8、儀測定細胞內(nèi)ND的熒光強度表明細胞內(nèi)吞ND-PEG-Tf是時間和濃度依賴的。細胞內(nèi)吞ND-PEG-Tf的量與細胞表面表達TfR的量密切相關(guān),利用Fe3+存在下游離Tf的抑制試驗證明細胞內(nèi)吞ND-PEG-Tf是由TfR介導(dǎo)的。依據(jù)高表達TfR的腫瘤細胞和低表達TfR的正常細胞差異,ND-PEG-Tf可選擇性的進入腫瘤細胞,靶向輸送藥物。使用MTT法對ND-PEG-Tf-DOX納米載藥體系的細胞毒性進行了研究,結(jié)果表明ND-PEG-Tf-D

9、OX對TfR表達較高的腫瘤細胞具有較大的細胞毒性,而與游離DOX的細胞毒性相比,ND-PEG-Tf-DOX可減小對TfR表達較低的正常細胞的毒性,即減小DOX的毒副作用。因此ND-PEG-Tf作為靶向藥物輸送載體對腫瘤的治療具有潛在的應(yīng)用。
　　5.對HepG2細胞內(nèi)吞ND-PEG-Tf納米顆粒后的生長曲線證明ND-PEG-Tf不影響細胞的生長,同時使用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡測定得到細胞內(nèi)的ND-PEG-Tf會隨細胞分裂將其