功能化多壁碳納米管與L02細胞的相互作用.pdf

1、納米材料具有優(yōu)良的物理化學特性，使得其在眾多領域具有很好的應用前景，但已有的一些研究表明納米材料存在潛在的毒性效應，因此在細胞及分子水平對納米材料的生物效應及毒理學機制進行研究非常有必要。功能化的多壁碳納米管由于其特殊的的理化性質，有望在生物醫(yī)學領域得到廣泛應用，但其生物安全性問題也逐漸成為關注的熱點。就目前來看，有關功能化的多壁碳納米管的細胞毒理學研究還不夠深入，已公開報道的研究結果也存在著極大的爭議。研究表明功能化碳納米管經呼吸，口

2、腔，皮膚或靜脈注射暴露于機體之后能進入循環(huán)系統(tǒng)，由于肝臟具有首過效應，且已有文獻也表明碳納米管能在肝臟中有大量的積累，所以探討功能化碳納米管與正常肝細胞的相互作用具有重要意義。本研究我們選用人正常肝細胞系LO2細胞作為模型細胞，探討了羧基化壁碳納米管、羥基化壁碳納米管以及未經修飾的多壁碳納米管與LO2細胞相互作用及其機制，從而為納米材料生物學效應的深入開展提供理論依據和實驗基礎。
　　 具體內容主要包括以下幾個方面：
　　

3、 (1)利用透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)、X-射線光電子能譜儀(XPS)對原始多壁碳納米管(MWCNT)、羧基化多壁碳納米管(MWCNT-COOH)和羥基化多壁碳納米管(MWCNT-OH)進行了表征。透射電鏡顯示三種碳納米管平均管徑均為10～20nm，長度均為10～30μm，掃描電鏡顯示碳納米管形貌相似，XPS分析顯示功能化多壁碳納米管分別在289ev和286ev處特征峰峰值明顯增高，說明材料分別修飾上了羧基和羥基。樣品中未

4、檢測出金屬催化劑雜質，各樣品純度均大于98％。
　　 (2)研究三種多壁碳納米管對LO2細胞的毒性。將濃度分別為12.5、25、50、100、200μg/ml的三種多壁碳納米管分別與LO2細胞共育24h、48h、72h，采用WST法和CellTiter-Glo（R）發(fā)光法考察碳納米管的對細胞活力的影響。WST法和CellTiter-Glo(R)發(fā)光法均顯示碳納米管的細胞毒性作用呈現(xiàn)濃度依賴性并與作用時間具有一定關系?？偟目磥?，羧

5、基化的多壁碳納米管比原始碳納米管在低濃度的時候具有更好的生物相容性，而后兩者之間差異不顯著。說明細胞毒性與其表面修飾的化學官能團有關，并且具有劑量依賴性。從細胞形態(tài)學觀察，Hoechst33342染核分析及細胞凋亡/壞死比例檢測發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管能導致LO2細胞凋亡，并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，功能化的多壁碳納米管相對原始多壁碳納米管不容易導致細胞凋亡。
　　 (3)研究三種多壁碳納米管對LO2細胞的氧化應激，細胞膜完整性和細胞周期的

6、影響。多壁碳納米管可以誘導活性氧自由基(ROS)的產生，增加谷胱甘肽(GSH)的耗竭。碳納米管誘導細胞內活性氧生成與共育時間有關：碳納米管與細胞作用36h以內時，細胞內ROS含量隨時間逐漸增加；36h后細胞內ROS含量隨作用時間延長逐漸降低。通過GSH-GloTM試劑盒檢測胞內還原型谷胱甘肽(GSH)的含量發(fā)現(xiàn)，LO2細胞暴露于200μ/mL的多壁碳納米管24h時，細胞內GSH含量顯著下降；暴露48h時，LO2細胞內GSH含量下降緩慢，

7、提示多壁碳納米管誘導LO2細胞發(fā)生氧化應激。乳酸脫氫酶(LDH)的測定結果顯示多壁碳納米管呈時間、劑量依賴性破壞質膜的完整性，增加了LDH的漏出。不同濃度的MWCNT作用LO2細胞24h后，細胞周期分布情況出現(xiàn)輕微的改變，與對照組相比，G0/G1期細胞百分數(shù)有所上升，G2/M期細胞百分數(shù)下降。說明多壁碳納米管可以導致細胞周期阻滯于G0/G1期，這也可能是其導致細胞毒性的機制之一。
　　 (4)研究三種多壁碳納米管對LO2細胞的線

8、粒體和細胞凋亡信號通路的影響。結果顯示多壁碳納米管誘導LO2細胞的凋亡可通過增加線粒體膜通透性，促使線粒體膜電位(MMP)的降低，使細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，激活Caspase-3和Caspase-9，同時還可以激活細胞凋亡死亡受體通路關鍵的酶Caspase-8。這些結果表明了多壁碳納米管可能是通過線粒體通路和死亡受體通路作用而導致LO2細胞凋亡。同時發(fā)現(xiàn)功能化多壁碳納米管不容易通過線粒體途徑導致細胞凋亡，這可能是導致其細胞毒性低